Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响.doc

靶向抑制PI3K/Akt信号通路对Smac基因表达与胃癌细胞凋亡的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:石松菁, 黄昌明石松长
【摘要】目的研究LY294002靶向抑制PI3K/Akt信号通路对线粒体激活因子(Smac)基因的表达及胃癌细胞凋亡的影响。方法将PI3K/Akt信号通路的靶向抑制剂LY294002加入胃癌细胞株SGC7901,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞增殖,DNA ladder检测细胞凋亡,原位细胞凋亡检测技术检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期,免疫组织化学检测Smac的表达。结果 LY294002致细胞存活率下降,且与时间、浓度呈正相关。在DNA电泳图上,对照组呈规则的基因组断裂条带,其亮度与药物作用时间呈正相关。流式细胞结果显示LY2940002处理后在细胞周期G1期前出现明显的凋亡峰,作用12 h时,%。Smac在胃癌细胞中仅在胞质中呈阴性或弱阳性表达;LY294002作用后,细胞质中出现棕黄色颗粒状浓染。结论 PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系密切。
【关键词】 1磷脂酰肌醇子激酶; 线粒体蛋白质类; 胃肿瘤; 肿瘤细胞, 培养的; 细胞凋亡
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率均较高,其异常的细胞凋亡和增殖在胃癌的形成和进展中具有重要意义。近年研究发现,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)的线粒体激活因子(second mitochondria
derived activator of caspases,Smac)是一种从线粒体内释放到细胞质中的重要凋亡调节蛋白,能增加Caspase3活性,促进细胞凋亡[1]。笔者拟通过LY294002靶向抑制胃癌细胞SGC7901来探讨PI3K/Akt信号通路、Smac基因与胃癌细胞的凋亡关系。
1 材料和方法
材料
细胞株胃癌细胞系SGC7901由本实验室传代培养,含10%小牛血清(美国SIGMA公司)的RPMI 1640培养基,在37 ℃培养箱中培养,2~3 d更换培养基1次
实验试剂 Smac多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);PI3K抑制剂LY294002(美国Promega公司);流式细胞仪(Coulter,Epicus ELITE,ESP,美国)。
方法
LY294002溶液的配置按照配制说明书先将 LY294002干粉5 mg充分溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液325 μL中,配制成50 mmol/L的LY294002溶液,移入-20 ℃冰箱储存,用前稀释成所需的浓度。
四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长活性选择对数生长期细胞,接种于96孔培养板,另设不加细胞的培养液为对照组。实验组分别给予终浓度为
10,30,50 μmol/L的LY294002(DMSO≤%),对照组加入同等浓度的DMSO,每孔设3个复孔。再培养4,8,12 h,每孔分别加入5 g/L的MTT 10 μL。加DMSO 100 μL,振荡。用酶标仪在波长490 nm处测每孔光吸收值(D),重复3次。计算: