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IL1β诱导大鼠肝细胞NO产生增多线粒体膜电位降低
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
【摘要】目的: 观察体外培养的大鼠肝细胞在促炎细胞因子IL1β刺激下一氧化氮(NO)的产生和线粒体膜电位的变化,探讨两者之间的关系。方法: 原位胶原酶灌注法分离和培养原代大鼠肝细胞后,分别用生理盐水、脂多糖(LPS)(10 mg·L-1)、IL1β(1 nmol·L-1)及LPS(10 mg·L-1)联合IL1β(1 nmol·L-1)刺激肝细胞,并分别在刺激后6、12、24、48 h留取细胞和上清液,采用分光光度法测定上清液NO的含量,采用荧光探针JC1结合流式细胞仪检测肝细胞线粒体膜电位的变化。结果: IL1β刺激后肝细胞产生NO增加而线粒体膜电位降低,两者均呈时间依赖性,并在24 h达峰值;LPS对肝细胞NO的合成没有直接诱导作用,与IL1β联合刺激也没有协同作用。结论: IL1β诱导肝细胞过度产生NO从而抑制线粒体呼吸功能可能是炎症应激下肝损伤的潜在机制之一。
【关键词】肝细胞; 线粒体;白细胞介素1β; 一氧化氮; 膜电位;大鼠
肝功能障碍是脓毒症患者常见的临床表现,也是导致脓毒症患者并发多器官功能障碍综合征(an dysfunction syndrome, MODS)及死亡的重要原因[1]。近年来发现,线粒体功能障碍导致的机体能量代谢异常可能在脓毒症向MODS的发生和发展过程中发挥了关键的作用[2
5],脓毒症时肝脏产生大量NO抑制线粒体呼吸功能可能是其潜在的损伤机制[67]。IL1β是脓毒症早期炎症反应过程中释放的一种促炎细胞因子,在体外能够诱导肝细胞NO合酶(iNOS)基因的表达,促进NO的产生[78]。以往的实验多通过ATP浓度或线粒体酶复合物活性来间接反映线粒体的功能[4,67],本研究旨在体外观察IL1β对大鼠肝细胞NO产生的影响,通过肝细胞线粒体膜电位的变化,从总体水平反映线粒体的功能,并探讨两者间的关系。
1 材料与方法
实验材料
内毒素大肠杆菌O111:B4型(Sigma公司,美国),重组大鼠IL1β(PeproTech公司,美国),RPMI 1640培养基(GIBCO公司,爱尔兰),小牛血清(民海生物工程有限公司,中国兰州),Ⅳ型胶原酶(Invitrogen公司,美国),DNaseⅠ(Sigma公司,美国),6孔培养板(Griner公司,美国),NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国南京),JC1荧光探针(Molecular Probe公司,美国)。
肝细胞的分离和培养
肝细胞分离采用本实验室改良的原位两步灌注法[9]:选取6周龄雄性SD大鼠(180~220 g),1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠后,腹部备皮碘伏消毒,作5~6 cm的腹正中切口,用7号头皮针管行门静脉及下腔静脉腹腔段置管,建立肝脏灌注回路,结扎下腔静脉胸腔段, mmol
·L-1 EDTA的DHanks液以20~40 ml·min-1的速度灌注5~10 min,去除肝脏血液,当下腔静脉流出液体变清后,第2步用含有Ⅳ型胶原酶的消化液进行循环灌注消化,消化液配方为100 ml Hanks液+50 mg Ⅳ型胶原酶+8 mg DNaseⅠ,当肝脏变软、肝包膜出现皱缩破裂说明消化充分,取出肝脏剪成碎块置入RPMI 1640培养基中,260目金属滤网过滤后,低速离心(50×g共5 min),反复洗涤3次可获得高纯度的原代肝细胞。通常可获得肝细胞总量为(1~2)×108个,细胞活力大于50%,纯度高于90%。将获取的肝细胞以1×106 ml-1的浓度种植于6孔培养板中,每孔加入2 ml细胞培养液,细胞培养液配方为RPMI 1640培养基+100 U·L-1青霉素+100 μg·L-1链霉素+ mg·ml-1 L型谷氨酰胺+ U·ml-1胰岛素+10%小牛血清。
实验分组
肝细胞在5% CO2 的37 ℃培养箱培养48 h后换新鲜培养液,换液后单孔细胞数量约为1×106个,选8块6孔培养板共48孔细胞,分成4组,每组12孔,分别用生理盐水(NS)、血清脂肪酶(LPS)(10 mg·L-1)、IL1β(1 nmol·L-1)和LPS(10 mg·L-1)加IL1β(1 nmol·L-1)处理,并分别在处理后6、12、24和48 h留取细胞检测线粒体膜电位,同时检测细胞上清液NO含量。
NO的检测
利用NO遇氧和水生成硝酸盐和亚硝酸盐的原理,通过反应体系将样本中的NO转化为硝酸盐,再采用分光光度法(DU800型分光光度计,美国Beckman公司)测定硝酸盐的