RNA干扰Twist基因对人膀胱癌T24细胞化疗敏感性的影响.doc

RNA干扰Twist基因对人膀胱癌T24细胞化疗敏感性的影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:沈彬管旌旌胡敬海王春喜
【摘要】目的构建转录因子Twist基因的短发卡状RNA ( shRNA) 质粒,转染人膀胱癌T24细胞株后检测T24细胞对羟基喜树碱(HCPT)的敏感性。方法体外构建Twist基因shRNA的表达质粒,脂质体法介导将其转染入T24细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用RTPCR法和Western印迹法检测转染后Twist mRNA 及蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)及流式细胞术(FCM)测定Twist shRNA 转染T24细胞后细胞对HCPT敏感性的改变。结果 Twist shRNA 转染组细胞Twist mRNA和蛋白的表达与其他两组相比明显下调(P<);HCPT敏感性与正常对照组相比明显提高(P<)。结论靶向Twist 基因的序列特异性shRNA 可增强T24细胞对HCPT的敏感性。
【关键词】 RNA干扰;羟基喜树碱;短发卡样RNA;Twist 基因
膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤,高发年龄为50~70岁,复发率高是其显著特点,因此绝大多数患者在进行肿瘤切除手术后需进行膀胱灌注化疗。羟基喜树碱(HCPT)是从珙桐科植物喜树中提取的微量生物碱,作为腔内灌注治疗膀胱癌的常用药,取得了一定的治疗和预防效果。随着基因治疗技术研究的逐步深入,大家逐渐认识其存在着局限性。为了弥补基因治疗的不足,本实验用Twist基因联合HCPT 对人膀胱癌T24细胞的体外杀伤作用进行比较,为基因治疗联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。

1 材料与方法
材料 Twist短发卡状RNA(shRNA)已由本实验室构建成功并证实可下调T24细胞中Twist基因mRNA和蛋白的表达〔1〕。脂质体转染试剂(Lipofectami2000)购于Invitrogen公司。膀胱癌T24细胞株购自中科院上海细胞研究所细胞库,胎牛血清和IMDM细胞培养基购自天津TBD公司。HCPT针剂由湖北黄石飞云制药有限公司出品。细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。
实验方法
Twist shRNA质粒构建和筛选〔1〕 Twist shRNA干扰序列:T。Twist基因引物:上游5′ GCAGTCTTACGA3′,下游5′GAGAAGGCGTAGC3′,表达长度277 bp。人内参GAPDH 基因引物序列:上游 5′ACATCGCTCAGACAC3′,下游 5′GAGGCATTGCTGATGATCTTG3′。
MTT法测定细胞对HCPT的药物敏感性实验分为正常细胞组、转染阴性对照质粒细胞组和转染Twist shRNA细胞组。取对数生长期细胞接种于96 孔板(1
×104cells/孔),加160 μl培养液37 ℃培养24 h 、、1、5、10、50、100 mg/L HCPT,每个浓度设6个复孔;继续培养48 h后加入20 μl(5 g/L)MTT。再培养4 h后尽量吸干培养液,加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解1