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TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:韩涛张勇孙书明, 孟艳玲, 李伟, 郭张燕, 杨安钢
【摘要】目的: 构建TRBP及其截短体真核表达载体, 并检测其在HeLa细胞中的表达。方法: 设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、 TAC、 TBC基因序列, 然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlagCMV4。用脂质体法转染HeLa细胞, 经 Western blot方法检测目的基因在转染细胞中的表达。结果: 经过酶切鉴定与测序证实, TRBP全长及其截短体TAB、 TBC、 TAC基因真核表达载体构建成功, 经Western blot可检测转染细胞中各基因的表达。结论: 成功构建了TRBP全长基因及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体, 在转染细胞中可以检测到目的基因的表达。
【关键词】 TRBP; RISC; miRNA; 真核表达
TRBP(TAR RNA binding proteins)首先作为HIV1反式激活应答(transactivation response, TAR)RNA结合蛋白被分离鉴定出来。TRBP全长366aa, 属于dsRNA结合蛋白家族, 具有3个dsRBD, 位于dsRBD2内部的KR
螺旋模序负责RNA结合, 第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用[1]。TRBP具有多种生物学功能, 包括调控精子生成与发育、抑制PKR激活、调节HIV1基因表达、参与RNAi(RNA interferenc)过程等。TRBP是PKR的强抑制物, 它通过直接结合和dsRNA扣押而发挥作用。TRBP不依赖PKR而依赖结构RNA, 对翻译也有直接作用[2]。TRBP促进HIV1的表达和复制, 在星形胶质细胞中PKR的高应答导致了HIV1的低复制和病毒结构蛋白的翻译低下, 而TRBP抑制PKR激活, 使病毒蛋白产生恢复, 从而增强了HIV复制。研究表明TRBP通过对抗PKR介导的抗病毒免疫而在病毒翻译中具有关键作用[3]。
TRBP、 Ago2和Dicer都在miRNA加工和RNAi中发挥作用。TRBP在dsRNA和Dicer之间募集Ago2时起到桥梁作用, TRBP或Dicer缺失后成熟miRNA产生减少和siRNA功能的丧失, 他们推断TRBP募集Ago2到RISC, 将RNAi的启动和执行阶段相偶联[4]。TRBP与RNaseⅢ家族成员Dicer相互作用, 并结合dsRNA, 随后结合具有裂解dsDNA活性的Ago2蛋白, 它们共同组成RISC复合体(RNAinduced plex)。dsRNA的一条链被递呈给Ago2蛋白从而导致siRNA 和miRAN的产生[5]。
在人细胞中TRBP是Dicer结合蛋白, 它为siRNA及miRNA功能的发挥所必需。为了进一步探讨TRBP与Ago2间的相互作用和miRNA的生成机制, 我们构建了TRBP全长及其截短体TAB、 TAC和TBC基因真核表达载体, 并在转染细胞中检测到了目的基因的表达, 为进一步研究其功能机制奠定了基础。
1 材料和方法
材料 DH5
α菌种、细胞系为第四军医大学免疫学