β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文
【摘要】目的: 构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因,(+)中,通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果:DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素(+)的多克隆位点。结论:成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。
【关键词】 Gal9; 构建; 真核表达载体
半乳糖凝集素家族(galectin family)成员参与了许多生理和病理过程,包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等[1,2]。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族(galectin family)成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面,发挥着重要作用[3]。目前对Gal
9发挥作用的具体机制仍知之甚少,值得进一步深入探讨和研究,从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此,本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体,为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。
1 材料和方法
材料
T4连接酶、限制性内切酶(MBI),Taq酶和RT试剂盒(Promega),RNA提取试剂盒(Invitrogen),质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen),DNA marker(Tiangen),Trizol、1640培养基,人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。
引物设计
参照GenBank上Gal9()序列设计引物如下:上游引物:P1 5’TCTACAA 3’,下游引物:P2 5’AC 3’,下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176 bp。
分离人外周血单个核细胞
静脉取血,加入肝素溶液(10~50u/m1血样本)抗凝, Hanks液将抗凝血稀释1倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中,加入稀释的全血; 2000 r/min离心20min;吸取所有单个核细胞,用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。
单个核细胞总RNA的制备、RT
(+)
将离心收集的单个核细胞1×105加入Trizol 1 mL,混匀,室温5 min; mL氯仿,涡旋15 s, 4℃12 000g,离心10 min, mL Eppendorf管,加入等体积预冷的异丙醇,放置10 min,4℃12 000g,离心10 min,去上清液,加入1 mL预冷的浓度为750 mL/L乙醇,充分混匀振荡,4℃12 000g,离心10