菌落计数doc.doc

、培养基和试剂1、平板计数琼脂(platecountagar,PCA)?:将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。分装试管或锥形瓶,121?高压灭菌15min。2、磷酸盐缓冲液成分磷酸二氢钾(KH2PO4):贮存液:,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121?高压灭菌15min。3、:,氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121?高压灭菌15min。二、操作步骤样品的稀释1、固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min,10000r/min均质1min,2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min,2min,制成1:10的样品匀液。2、液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。3、用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100的样品匀液。4、按3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。5、根据对样品污染状况的估计,选择2个,3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6、及时将15mL,20mL冷却至46?的平板计数琼脂培养基(可放置于46??1?恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。培养1、待琼脂凝固后,将平板翻转,36??1?培养48h?2h。水产品30??1?培养72h?3h。2、如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4mL),凝固后翻转平板,。菌落计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。1、选取菌落数在30CFU,300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。2、其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。3、当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。三、结果与报告菌落总数