分子实验报告.doc

质粒DNA和λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定韩阳 生技一班 20071401039一、实验原理通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。核酸酶按照水解断裂核酸分子不同方式分为两类:一类是从核酸分子的末端开始,一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,叫做核酸外切酶;另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段,叫做核酸内切酶。限制性核酸内切酶:一类可以识别并切割特定DNA序列的核酸内切酶。其中以II型内切酶最为常用,大多数II型内切酶可以识别4—8个核苷酸构成的某一核苷酸序列,这一序列通常呈回文结构。一般来说,特异性识别序列越短,在DNA中出现的频率越大。限制酶的切割方式有三种,分别产生突出3’的粘性末端、突出5’的粘性末端和平末端,通常粘性末端更容易被DNA连接酶所连接。本实验使用的HindIII酶特异性识别DNA序列AAGCTT,并在AA之间处切割产生5’的粘性末端。DNA连接酶:最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。,其中前者只能催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接,而后者既可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的连接,还可以催化平末端的连接,但平末端连接效率低。本实验采用的是T4DNA连接酶。HindiIII:从流感嗜血杆菌d株中发现并分离的第三种限制酶。酶切方法:1、双酶切法:如果只在要克隆的目的DNA两端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点而目的基因内部没有相应的识别序列,可用两种限制性内切酶切割,则目的DNA可产生两种不同的黏性末端。选择同样具有这两种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体,酶切后,同样产生两个不同的黏性末端,当构建重组分子时,目的DNA片段可以一定的方向插入载体中,这样重组效率高,也有利于重组子的筛选。2、单切酶法:如果目的DNA只能用一种限制性内切酶切割,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体在构建重组分子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中,甚至出现载体分子自连,重新环化的现象,因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子,筛选重组子的工作量会很大。pUC19载体在试验中能较简单地区分重组子,因而本实验采用pUC19+单切酶法的组合。CaCl2制备感受态细胞:经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。在低温下,将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合,经过热击或电穿孔技术,使载体分子进入受体细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达,使受体细胞出现新的性状。将这些转化后的细胞在选择培养基上培养,即可筛选出重组子。,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后将pUC19质粒在42摄氏度下热击90s,实现转化。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因,在含