组织裂解液和细胞裂解液的配制.doc

--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________组织裂解液和细胞裂解液的配制组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:150mMNaCL1%NP-40(去垢剂)%SDS(去垢剂)2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)(蛋白酶抑制剂)1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。2、(钒酸钠)(任选)3、对数期生长状态佳的细胞,75cm至少3-4瓶(90%以上生长面积)。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上,用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面,以洗去瓶中残留的培养基,倒掉PBS,重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS,尽量在冰上操作。2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞,如果所需要刮的同种细胞有多瓶,则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠,所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中(置于冰上),然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中,样品插入冰盒进行超声,超声强度以不产生泡沫为准,超声每次2-3秒,重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀,应离心10000rpm,10分钟,留取上清。5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度(用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计,在A280测定),分装保存在-70℃。4方法二NP-40orTriton-1001%TrisHCl()50mmol/LNaCl150mmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)(100µg/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)1µmol/L(µg/ml)Leupeptin(亮抑制肽)(抑蛋白酶肽)µmol/L(1µg/ml)(注:PMSF贮存液:100mmol/;Aprotinin贮存液:10mg/();Leupeptin贮存液:10mg/ml溶于水中;Pepstatin贮存液10mg/-20℃保存)裂解操作程序:*离心收集1×107个细胞*加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl*剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀(如为组织进行匀浆)*4℃放置15~30min*4℃离心,15000rpm,10min,取上清备用。 方法三细胞裂解液的主要目的:,破裂细胞;;;:.50mMTris-·150mMNaCl等渗体系·1mMPMSF强大的蛋