组织裂解液和细胞裂解液的配制.doc

组织裂解液和细胞裂解液怎样配制?
一、细胞裂解液配制
方法一
一、试剂准备
1、新鲜配制冷 RIPA 裂解缓冲液:
150 mM NaCL
1% NP-40 (去垢剂)
% SDS (去垢剂)
2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)
2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)
1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)
mM EDTA (蛋白酶抑制剂)
1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)
以上全部试剂均按百分比溶于150 mM NaCL溶液中。
2、冷PBS 中加入 1 mM PMSF
mM EDTA
1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)
3、对数期生长状态佳细胞，75cm最少3-4瓶（90%以上生长面积）。
二、试验步骤
1、将长满细胞培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够冷 PBS在培养瓶中充足洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留培养基，倒掉PBS ，反复以上操作2-3遍。在最终一次洗涤中尽可能吸干残留PBS，尽可能在冰上操作。
2、 向培养瓶中加入冷RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，假如所需要刮同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (因为处理后细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点吸液管吸收)。
3、 吸出刮好细胞裂解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后反复步骤2以刮取剩下细胞。
4、尽可能将多细胞裂解液搜集到14ml离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，反复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。
5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保留在 -70
℃。
4方法二
NP-40 or Triton-100 1%
TrisHCl (pH ) 50mmol/L
NaCl 150mmol/L
PMSF（苯甲基磺酰氟） (100µg/ml)
Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(µg/ml)
Leupeptin（亮抑制肽）
Aprotinin（抑蛋白酶肽） µmol/L(1µg/ml)
（注：PMSF 贮存液：100mmol/；
Aprotinin 贮存液：10mg/();
Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；
Pepstatin 贮存液 10mg/-20℃保留）
裂解操作程序：
* 离心搜集1×107 个细胞
* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl
* 猛烈震荡使细胞充足悬浮混匀（如为组织进行匀浆）
* 4
℃放置15~30min
* 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。
 
方法三
细胞裂解液关键目标：，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活