构建点突变质粒步骤.doc

基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则:(1)通常引物长度为25~45bp,我们建议引物长度为30~35bp。一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12bp。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。(2)如果设定的引物长度为30bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%)。(3)如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。(5)最好使用经过纯化的引物。Tm值计算公式:Tm=×(%ofGC)–675/L+:L:引物碱基数;%ofGC:引物GC含量。四、引物设计实例以GCG→ACG为例:5’-TTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’(1)首先设计30bp长的上下游引物,并将A(T)设计在引物的中央位置。Primer#1:5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer#2:5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=(Tm=×40-675/30+)。通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。(3)重新调整引物长度。Primer#1:5’-TTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’Primer#2:5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’在引物两端加5mer(斜体下划线处),%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,(Tm=×-675/35+),这样的引物就可以用于突变实验了。五、突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GCbuffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。六、如何去掉PCR产物最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲