聚合酶链式反应(PCR).ppt

实验七聚合酶链式反应(PCR)一、实验目的掌握PCR技术的一般方法和原理。了解PCR的应用。PCR技术发展速度惊人,没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛二、原理类似于DNA的体内复制。首先将待扩增的DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。3´5´3´3´3´3´3´3´3´3´3´5´5´5´5´5´5´5´5´5´模板DNA双链第一步:变性双链间氢键断裂单链形成第二步:退火退火引物与模板互补结合第三步:延伸DNA链延伸,形成新的双链DNA5´5´3´3´循环三、引物设计原则引物长度约为15-30bp引物中G+C含量通常为40%-60%。引物长度小于20时,引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T)。)四种碱基应随机分布,在3‘端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构两引物之间尤其在3‘端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基三、材料模板DNA为前次提取的质粒。四、仪器移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪,琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪),台式高速离心机。五、试剂1、10×PCR反应缓冲液:500mmol/LKCl,100mmol/LTris·Cl,在25℃下,,%TritonX-100。 2、MgCl2:25mmol/L。 3、4种dNTP混合物:。 4、TaqDNA聚合酶5U/μl。5、引物1和引