16SrDNA鉴定细菌的方法.docx

16SrDNA鉴定细菌的方法.docx16SrDNA鉴定细菌的方法16SrDNA鉴定主要分为7个部分:1•提取细菌基因组DNA,2•设计/选择引物进行PCR扩增,电泳检测纯度与大小。琼脂糖凝胶电泳分离胶回收目的片段目的片段测序。BLAST比对获取相似片段。构建系统进化树试剂:1培养基:通常选择纽分简单口细菌生长良好的培养基(培养基组分过于复杂会影响DNA的提取效果,也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。)。2lMTris-HCl(,,)(IL):,加浓盐酸约(70ml,60ml,42ml),高温高盐灭菌后,室温保存。冷却到室温后调pH,每升高1°C,。()(1L):・2H20,用NaOH调pH至8・0(约20g),高温高压灭菌,室温保存。10XTEBuffer(,,&0)(1L):组分:100mMTris-HC1,10mMEDTAolMTris-HCl(,,)取100ml,()取20ml0高温高压灭菌,室温保存。1XTEBufferJ|J10XTEBuffer稀释10倍即可。10%SDS(W/V):称10g,68°C加热溶解,。室温保存。用Z前在65°C溶解。配置时要戴口罩。6、 5MNaCl:,高温高压灭菌,4°C保存。7、 CTAB/NaCl(10%CTAB,):,加lOgCTAB(十六烷基三甲基漠化钱),加热搅拌。用Z前在65°C溶解。8、 氯仿/异戊醇:按氯仿:异戊醇=24:1(V/V)的比例加入异戊醇。9、 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):按苯酚与氯仿/异戊醇=1:1的比例混合Tris-HC1平衡苯酚与氯仿/异戊醇。10、 TAE缓冲液:使用液IX:-乙酸,:242gTris,,()。11、 6X上样缓冲液(100ml):%漠酚蓝(BPB),40%蔗糖,10niniol/LEDTA()(),4°C保存。12、 %琼脂糖凝胶:。13、 EB:10mg/mlo称取lg漠化乙锭定容至100mU棕色瓶室温避光保存。(因EB是剧毒物质,目前很多实验室用生物荧光染料替代,常川的有Gelred等)14、 蛋白20mg/ml溶于水,-20°C保存,反应浓度50ug/ml,反应缓冲液:(),,5%SDS,反应温度37-56°C。无需预处理。15、 RNaseA:10mg/mlo25mgRNaseA加1IMTris()25ul,,无菌水2460ul,T100°C加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存丁-20°C。(为避免RNA的干扰,使用RNA酶降解基因组中的RNAo)1・1细菌基因组DNA提取基本步骤:材料准备破碎细胞或胞膜一内容物禅放核算分离、纯化沉淀或吸附核酸,并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器:高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5利*不同的方法所选择的试剂会有所不同。,12000rpm离心lmin,丢去上清夜,收集菌体。加入400ul裂解液(40mMTris-ffi酸,20mM醋酸钠,lmMEDTA,1%SDS,)混匀,置于37°C水浴lhro然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀示于13000rpm离心15mino取上清液,川苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M,),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4°C保存备用。2蛋白酶/,用WashingTE(50mmol/LTris-,lOmmol/)洗菌体2次。将菌体充分悬浮在5ml1XTE缓冲液中,>%SDS,轻轻混匀后50°C放置3h-5ho