DIG Northern标记及杂交检测试剂盒中文说明书 图文.doc

DIG Northern标记及杂交检测试剂盒中文说明书_图文DIGNorthernStarterKitDIGNorthern标记及杂交检测试剂盒说明书版本:(2010年8月利用体外转录法进行地高辛标记的RNA探针合成反应,采用酶联免疫方法及即用型化学发光底物CDP-Star进行杂交分子的检测。利用本试剂盒可进行10次标记反应,和10次杂交检测反应(10×10cm2杂交膜。产品目录号:**********试剂盒于-15~-25℃(((((((((-RNA标记(((((((174附录(((,参见下表,请注意所有试剂应使用DMPC或DEPC处理的水配置:带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。,以地高辛(DIG,一种甾类半抗原标记的UTP为底物,进行RNA探针的标记合成,所获得的单链RNA探针用于后续的杂交反应,带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应和CDP-Star底物进行化学发光检测。应用尼龙膜上的Northernblots杂交反应样本•线性化质粒,质粒上含相应的RNA聚合酶启动子序列(SP6,T3,T7注意:质粒上待转录的目标片段长度应在200-1000bp。为避免RNase污染,DNA模板须经酚抽提处理。•特殊制备的PCR产品(•对1μgDNA进行10次标记反应,每次反应产出约20μg标记的RNA探针•10次杂交检测反应(10×10cm2杂交膜试剂盒保存/稳定性未开启的试剂盒可在-15~-25℃下稳定保存至产品有效期限,具体日期请见试剂标签说明。试剂盒开启后,不同的试剂盒组分请在下表所列的条件下保存:,可检出极低浓度mRNAs。•使用HighPurePlasmidIsolationKit*制备纯化质粒DNA•在克隆子插入片段的下游酶切位点将DNA模板酶切线性化,转录区域的片段长度范围应在200-1000bp。•为避免转录冗余的序列,使用产生5’-粘性末端或平末端的限制性内切酶。•酶切反应后,使用酚氯仿纯化DNA,再进行乙醇沉淀。•将DNA模板溶解于10mMTris,,:EDTA浓度过高将抑制转录反应,。-PCR和PCR方法制备DNA模板反应原理使用以下方法进行DNA模板制备,可免去进行克隆反应。不同RNA酶的启动子序列:•PCR仪•ExpandHighFidelityPCRSystem•引物•dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM反应步骤以下是应用ExpandHighFidelityPCRSystem进行PCR反应的推荐操作步骤:-RNA标记反应原理利用体外转录反应和地高辛标记的核苷酸DIG-11-UTP对DNA模板进行体外转录,获得标记的RNA探针。转录缓冲液和标记混合液专为标记反应优化。反应所需的仪器和其他试剂•水浴设备•冰或冰水浴