16s rdna菌种鉴定.doc

16s rdna菌种鉴定.doc16SrDNA方法鉴定细菌种属目的掌握16SrDNA对细菌讲行分类的原理及方法;掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段冋收等实验操作。二、 原理随着分子生物学的迅速发展,细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平,如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。细菌屮包括有三种核糖体RNA,分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA±的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析,但核背酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23SrRNA含有的核背酸数几乎是16SrRNA的两倍,分析较困难。16SrRNA相对分了量适屮,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。在细菌的16SrDNA屮有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此,16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分了。随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库屮,这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。1、 16SrRNA普遍存在于原核生物屮。rRNA参与生物蛋白质的合成过稈,其功能是任何生物都必不可少的,而且在生物进化的漫长历稈屮保持不变,可看作为生物演变的时间钟。2、 在16SrRNA分子屮,既含有高度保守的序列区域,乂有屮度保守和高度变化的序列区域,因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。3、 16SrRNA的相对分了量大小适屮,约1540个核廿酸,便于序列分析。4、 可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16SrDNA片段扩•增出來,利用可变区序列的弄异来对不同菌属、菌种的细菌讲行分类鉴定。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SQNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速秋得细菌种屈信息的方法。利用16SrDNA鉴沱细菌的技术路线:序列比对三、操作步骤(一)细菌基因组DNA提取挑单菌落接种到10mLLB培养基屮37°C振荡过夜培养。取2mL培养液到2mLEppendorf管屮,8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。加140ULTE打散细菌,再加入60uL10mg/ml的溶菌酶。37°C放置10分钟。加入400uLDigestionBuffer,混匀。再加入3uLProteinK,混匀,55°C温育5分钟。加入260UL乙醇,混匀,全部转入UNIQ-10柱屮。10000rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。加入500UL70%乙醇(WashSolution),。重复第六步。再10000rpm离心2分钟彻底电干乙醉。吸附柱转移到一个新的l-5mL的离心管。加入50口预热(60°