真菌分离以及培养.doc

真菌分离以及培养.doc一、 (越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期植物检疫胡佳王卫芳..)1、 病原菌分离采用纟ft织分离法,取病果病健交界果皮纟H•织分离培养(马伶薯葡萄糖琼脂培养基[PDA],25°C,12h荧光与12h黑暗循环交替),病菌纯化后保存备用。2、 病原菌培养特征和形态观测取病果病部组织进行徒手切片,显微观察分生他子盘和分工砲了的形态特征;观察病菌的培养特性(PDA,25oC,12h荧I2h黑暗循环交替);观测分离物分生砲子的形态和大小;从培养7d的菌落屮挑取分生抱了团,配制成抱了悬浮液,采用载片悬滴法,观测附着他的形态及大小。3、 病原菌18SrDNA序列扩增与测定将纯化菌株置于PDA、25oC、12卜荧~/12h黑暗循环交替条件下培养5d,挑取菌落边缘新鲜菌丝,采用常规CTAB法提取病原菌基因组DNA作扩增模板,进行PCR扩增。所用引物为真菌18SrDNA通用引物GeoA2和Geoll[9J。反应体系为25总体积,,10倍PCR缓冲液(含MgC12)2・ 5IxL,dNTP(2・ 5mmoI/L)2L,GeMl(10I~moI/L)1L,GeoA2(10lxmoL/L)lLTaq(5u/lxL)O・125L,模板DNA2L。反应程序为94°C预变性2min,94oC45s,55oC45s,72oC2min,30个循环,72~C延伸10min,4°C保存。PCR产物送上海英骏生物有限公司纯化测序。测序结果与GenBank数据库屮的已知序列进行BLAST比较。4、 致病性测定选取健康柑橘(Citrusreticulata)、苹果(MaIuspumiIa)果实,经70%酒精表面消毒后晾干备用。 从在PDA、25oC、12h荧光/12h黑暗循环交替条件下培养7d的菌落上挑取分生抱了团,用无菌水配成分生砲了悬浮液(100倍镜下50-60个他了)o用灭菌针刺伤果皮,用无菌滤纸片沾取抱了悬浮液覆盖在针刺部位接种,以无菌水作对照。用保鲜膜分别包裹接种果和对照果,封口,放置经70%酒精消毒过的駛料箱屮,于25oC、12h荧光/12h黑暗条件下保湿培养,定期观察症状发展过稈。发病的果实按照2的方法重新分离病原菌,做Kohn法则确认是否同种致病菌。二、 (苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果的研究)炭疽菌培养参照方屮达等的方法在含有PDA培养基的试管斜面上接种炭疽菌,7d后用10mL无菌水冲洗抱了再倒入250mL内有玻璃珠、灭菌的三角烧瓶屮(约1X1了个抱了/mL),置摇床上20min,使抱子团充分分散,涂平板12个待用。涂平板仍参照方中达的方法苹果炭疽病菌在PH3-10范围的PDA培养基上均能生长和产抱,最适菌丝生长的PH值为4,分生抱了产生的最适pH值为4-5,三、 (东北农业大学农学硕士学位论文南瓜疫病菌(尸彻toPhthor。。aP:iciLeon.)毒索致病机理及抗源筛选研究)生物测定法包括幼苗浸溃法、离体叶片浸渍法、叶片针刺、涂抹和喷雾测定、植物愈伤纽•织测定法、离体根冠细胞测定法、线粒体测定法、叶绿体测定法、细胞膜测定法等。酶水平的生物测定有ATP酶法、PAL酶法、核糖核酸和脱氧核糖核酸酶法、SOD酶法、POD酶法、MOD酶法。代谢水平的生物测定有种苗偶联能量的测定、苯丙烷类代谢途径的测定、离子吸收测定和C02暗固定测定法