O型口蹄疫和伪狂犬病二价基因工程疫苗研究.pdf

摘要口蹄疫(FootandMouthDiseaseFMD)是由口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirusFMDV)弓I起的偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病,是危害畜牧业最严重的传染病之一,也是造成家畜及其产品国际贸易受阻的重要疾病,被国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)在国际动物卫生法典中列为18种A类传染病之一,近年又被列为重大跨国动物疫病的全球消灭计划及生物武器安全公约组织重点检查对象。中国政府公布的《动物病原微生物分类明录》将口蹄疫病毒列为十种一类动物病原微生物之一。FMDV属于小RNA病毒科(aviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus),有七个血清型,分别为A、O、C、AsiaI和南非SATI、SAT2、SAT3,每种血清型里又可分为许多亚型,不同血清型之间没有交叉保护力,其中O型口蹄疫分布最广,在非洲、南亚、中东和南美许多国家广泛分布,在我国的口蹄疫病例大多都是O型口蹄疫。免疫预防接种是控制乃至消灭口蹄疫的主要措施,目前使用O型口蹄疫灭活疫苗预防该病,取得了一定的效果,但是仍需改进。本研究以伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)基因缺失株TK'/gE'/LacZ+为载体,融合表达具有免疫增强作用的牛疱疹病毒I型VP22基因和O型FMDV的主要抗原基因P1或Pl/2~3C,构建了基因工程二价疫苗株,达到一针预防两种疾病的目的。(+)。用Balb/e小鼠模型比较了重组病毒TK/gE'/、TK-/gE'/.。、O型口蹄疫病毒P1和P1/2A/3C基因的克隆与序列分析为了将VP22基因分别与FMDV的P1基因和P1/2A/3C基因的5’端按照正确的阅读框架融合,首先设计一对分别含有Hin棚和&DRV酶切位点的上、下游引物,从含有牛疱疹病毒I型VP22基因的重组质粒中扩增出不含终止密码子的牛疱疹病毒I型VP22基因编码区;再用分别含有EcoRV和XbaI酶切位点的上、下游引物,从含有O型FMDVP1基因和P1/2A/3C基因的重组质粒中分别扩增出不含起始密码子的P1基因和P1/2A/3C基因;将扩增的VP22基因、Pl基因和P1/2A/3C基因,,-VP22、--P1/2A/3C。DNA测序结果表明,三个基因的序列与已经公布的序列完全一致。。T-VP22后,凝胶回收VP22基因,(+)的HindlII和EcoRV酶切位点之间,;-P1和pMDl8-T-P1/2A/3C分别用&DRV和XbaI酶切后凝胶回收,,使其与VP22的3’端融合,。然后用Balb/—.P1/2A/3C的免疫效果。结果显示,首免后14天和28天,四种DNA疫苗均产生了可以检测到的FMDVELISA抗体和中和抗体;含VP22的DNA疫苗(pcDNA-、)的抗体水平在二免后显著高于不含VP22的DNA疫苗(pcDNA-P1、pcDNA-P1/2A/3C)(P<);DNA疫苗与FMDV灭活疫苗联合免疫的抗体水平显著高于DNA疫苗单独免疫(P<),但与FMDV灭活疫苗单独免疫没有显著差异(P>)。淋巴细胞增殖试验结果显示,DNA疫苗诱导细胞免疫的水平远远高于FMDV灭活疫苗(P<)。,构建了转移载体plECMV--VP22-P1/2A/3C。以PRVTK'/gE'/LacZ+为亲本株,