生物检测技术——pcr技术.ppt

生物检测技术——PCR技术聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR),体外核酸扩增技术。?能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。?PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系,其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。PCRPCR技术的创建技术的创建KaryKary B. Mullis B. Mullis(穆利斯(美))(穆利斯(美))??Khorana(1971)Khorana(1971)等提出在体外等提出在体外经经DNADNA变性变性,,与适当引物杂交与适当引物杂交,,再再用用DNADNA聚合酶延伸聚合酶延伸,,扩增扩增DNADNA的的设想。设想。?19831983年年,Mullis,Mullis发明了发明了PCRPCR技技术术,,使使KhoranaKhorana的设想得到实现。的设想得到实现。?19881988年年SaikiSaiki等将耐热等将耐热DNADNA聚合酶(聚合酶(TaqTaq)引入了)引入了PCRPCR技技术术??19891989年美国年美国《《ScienceScience》》杂志杂志列列PCR PCR 为十余项重大科学发明为十余项重大科学发明之首之首,,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸爆炸年年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔年度诺贝尔化学奖化学奖。。PCR技术的原理?PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法,反应原理与细胞内的DNA复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以拟扩增的DNA分子为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持l5到3O秒,使模板DNA双链解旋成两条单链;然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;最后在引物、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。如此循环20次原始DNA将扩增约l0的六次方倍。经过扩增后的DNA产物多为介于引物与原始DNA想结合的位点之间的片段。PCR原理图PCR的基本成分?PCR反应所需成分主要有模板DNA,一对核苷酸引物,缓冲液,四种三磷酸脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶以及一些离子。?模板:就是需要扩增序列的核苷酸,来源很广,几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。?引物:是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的核苷酸片段,是决定PCR特异性的关键。?缓冲液:要维持PCR反应的pH,必须用到缓冲液,最常用的是10~50mmol/L的Tris-HCl,在PCR反应中,~。?三磷酸脱氧核苷酸:四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)是PCR反应的原料。四种各dNTP分子浓度必须相等,以减少错配。?耐热DNA聚合酶:耐热DNA聚合酶的发现,实现了PCR的自动化,能经受95℃以上的高温而不失活。?其他成分:二价Mg离子能活化DNA聚合酶;DMSO有利于DNA的变性;TMAC可去除非特异扩增,促进PCR;甘油有利于DNA复性,不过并不是对所有的PCR都有利。PCR反应条件优化选择?首先是PCR反应循环阶段的优化选择:变性的温度和时间的控制,一般在第一轮循环前先进行94℃预变性3~l0min,以便使模板D N A完全解链,然后加入TaqDNA聚合酶趁热启动,这样可减少聚合酶在低温下仍有活性而引起的非特异性扩增;退火温度的控制,一般来说,退火温度越高,所得产物的特异性越高,但也不能太高,否则会影响引物与模板的碱基配对;延伸的温度和时间控制,一般延伸的温度设定在所用DNA聚合酶的最适温度附近,若不合适的温度,不仅影响产物的特异性,也会影响产量;延伸时间不宜过长,否则会导致非特异性产物扩增带的出现。?然后是PCR反应成分的优化选择:模板核酸首先必须纯化,除去蛋白酶等杂质,浓度因反应不同而有所选择;引物首先要质量高,需纯化,引物设计要合理;反应缓冲系统中常加入KCl而有利于退火,对于不同PCR反应,缓冲条件亦有所不同;三磷酸脱氧核苷酸的浓度应适宜,过高可加快反应速度,但同时也增加了碱基错配率,反之可提高反应的特异性;耐热聚合酶的浓度也应适宜,过少会影响靶序列扩增产量,过的会导致非特异性的扩增。?最后是采用热启动的方法使耐热DNA聚合酶仅在反应体系到较高的温度是才发挥作用,消除非特异性的扩增,提高PCR反应的特异性和敏感性。