用16S-rDNA方法鉴定细菌种属.doc

用16SrDNA方法鉴定细菌种属一、;、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、实验原理细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常见的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝,5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。16SrDNA由于大小适中,,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。16SrRNA的编码基因是16SrDNA,可是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16SrDNA鉴定细菌,其技术路线如下:细菌培养液基因组DNA16SrDNA片段连接克隆载体阳性克隆鉴定测序片段回收DNA提取PCR扩增细菌基因组的提取:得到胞内可溶物质菌体破碎纯化DNA分离出DNAPCR的基本原理:PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。二、操作步骤1、细菌基因组DNA提取;2、PCR扩增;3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测;4、扩增片段回收;5、DNA片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时,紫外灯下条带呈现绿色荧光,将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来,放入已称重的2ml离心管中,,,,则凝胶为400mg,因此加入的BindingBuffer为1200μl。我们小组选用B116Ssequence,以下为制作进化树过程:1、根据B116S基因序列,到NCBI上比对,确定其种属(1)NCBI主页()依次点击进入BLAST(2)选择nucleotideBLAST将B1序列复制到文本,框里ChooseSearchSet处点复选按钮others,最后点BLAST点击BLAST后,数据进行提交。BLAST结果