酶活性测定.doc

实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)等。它们普遍存在于植物的各种组织中,能够经过催化植物体内的活性氧,防止发生氧化反应。因此抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系,经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶(SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基()的酶,它催化下列反应:2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系,故成为植物逆境生理学的重要研究对象。【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。后者在560nm处有最大吸收,而SOD可清除从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量,据此能够计算出酶活性大小。【仪器与用具】高速台式离心机;分光光度计;微量进样器;荧光灯(反应试管处光照强度为4000lx);试管数支;黑色硬纸套。【试剂】()。(内含1%聚乙烯吡咯烷酮)。(Met)溶液:。(NBT)溶液:,现配先用,避光保存。-Na2溶液:-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。:。【材料与方法】:取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉),加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,倒入5ml离心管中,用提取介质冲洗研钵2~3次,最后加缓冲液使终体积为5ml。于10000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。:取试管(要求透明度好)7支,3支为样品测定管,3支为对照管,另外1支作为空白,按表1加入各溶液。混匀后将空白管置暗处,其它各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,反应室的温度高时时间可适当缩短,温度低时时间可适当延长;温度范围30-37度)。【结果处理】SOD活性测定与计算至反应结束后,以不照光的作空白,分别测定其它各管560nm波长下的吸光度值,已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性:SOD总活性(U·g-1FW)=式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;A0—照光对照管的吸光度值;AS—样品管的吸光度值;VT—样液总体积(ml);V1—测定时样品用量(ml);FW—样重(g);表1-1各溶液加入量试剂(酶)测定管用量(ml)空白和对照管用量(ml)