土壤酶的测定方法.docx

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源,它的活性可以用来表示土壤供氮能力。1、试剂配制:(1):取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中,另取295g氢氧化钾溶于水,再将两种溶液合并,,并用水稀释至2L。(2)苯酚钠溶液:,,后用乙醇稀释至100mL(A液),保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中(B液),保存于冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混和,并用蒸馏水稀释至100mL备用。次氯酸钠溶液:%,溶液稳定。10%尿素溶液:10g尿素溶于100mL水中。N的标准溶液:,,再将此液稀释10倍制成氮工作液()。2、操作步骤称取5g土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24h。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液,加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20min后,将混合物稀释至刻度,在波长578nm处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制:分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中,加蒸馏水至20mL,再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀,20min后显色,定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。3、结果计算以24小时后1g土壤中NH3-N的质量(mg)表示脲酶活性(Ure)Ure=a·V·n/m式中:a为由标准曲线求得的NH3-N浓度(mg/mL);V为显色液体积(50mL);n为分取倍数;m为烘干土重(g)。(容量法)(比较好测)%过氧化氢溶液:按1:100将30%H2O2用水稀释3N硫酸(???????????)(1/5KMnO4)溶液:,溶于1升无CO蒸馏水中,贮于综色瓶中,备用。2(1)取2g风干土,置于100mL三角瓶中,%H2O2溶液。同时设置对照,%过氧化氢溶液,而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min后,加入5mL3N硫酸,以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液,。(毫升数)为B,用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。(A-B)×T即为过氧化氢酶活性。。(????)式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。(就是最后换算成每克,所以还要测土壤含水量)()于105~110℃烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL(8+92)硫酸溶液中,用配制好的高锰酸钾溶液[c(KMnO4)=]滴定,近终点时加热至65℃,继续滴定至溶液呈粉红色保持30s,同时作空白试验。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*c(1/5KMnO4)=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度,mol/L;m——草酸钠之质量,g;V1——高锰酸钾溶液之用量,mL;V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量,mL;——(1/5KMnO4)=。三、蔗糖酶测定(比色法):1、试剂配制(1)3,5-二硝基水杨酸溶液:,溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中,再加30g酒石酸钾钠,用水稀释至100mL(不超过7天)。(2):1/15M磷酸氢二钠(2O溶于1L蒸馏水中)()。8%蔗糖溶液:80g蔗糖溶于1000mL水中甲苯标准葡萄糖溶液:将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水中,即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL)。