primer5和oligo使用的基本技巧.doc

最近我也在设计引物,也简单谈一下用primer5和oligo使用的基本技巧一、“Premier”的主要功能分四大块,其中有三种功能比较常用,即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA基元(motif)查找。“Premier”还具有同源性分析功能,但并非其特长,在此略过。此外,该软件还有一些特殊功能,其中最重要的是设计简并引物,另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物,由于大多数氨基酸(20种常见结构氨基酸中的18种)的遗传密码不只一种,因此,由氨基酸序列反推DNA序列时,会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物,它们的序列组成大部分相同,但在某些位点有所变化,称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异,比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择,有纤毛虫大核(CiliateMacronuclear)、无脊椎动物线粒体(InvertebrateMitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(PlantMitochondrion)、原生动物线粒体(ProtozoanMitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(VertebrateMitochondrion)和酵母线粒体(YeastMitochondrion)。“Premier”软件启动界面如下:其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单,点击该功能按钮后,选择相应的限制性内切酶或基元(如-10序列,-35序列等),按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时,点击按钮,界面如下:进一步点击按钮,出现“searchcriteria”窗口,有多种参数可以调整。搜索目的(SeachFor)有三种选项,PCR引物(PCRPrimers),测序引物(SequencingPrimers),杂交探针(HybridizationProbes)。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sensePrimer,或Both),或者成对查找(Pairs),或者分别以适合上、patiblewithSense/Anti-sensePrimer)。另外还可改变选择区域(SearchRanges),引物长度(PrimerLength),选择方式(SearchMode),参数选择(SearchParameters)等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求,建议使用默认设置。然后按,pleted时,再按,这时搜索结果以表格的形式出现,有三种显示方式,上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式,并按优劣次序(Rating)排列,满分为100,即各指标基本都能达标(如下图)。点击其中一对引物,如第1#引物,并把上述窗口挪开或退出,显示“