细胞培养用液的配制与消毒.doc

细胞培养用液的配制与消毒.doc细胞培养用液的配制与消毒一、器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤:水的制备:细胞培养用水必须菲常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、(也可用于其它BSS,$0:Hanks,D-IIanks液的配制):1•溶解定容:将药品(,,,)倒入盛有双蒸水的烧杯屮,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶屮准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸惚水补充蒸发掉的水份。朕蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用吋间有关,、温度为37°C时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+.Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰稱溶液吋应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1•称取腑蛋白酶:%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯屮的双蒸水()或PBS(D-hanks)液屮。搅拌混匀,置于4°C内过夜。2•用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液耍在超净台内用注射滤器()抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20°C保存以备使用。青、链霉索溶液的配制于消毒1•所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。使用时溶入培养液屮,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克RPMI1640的制备与消毒:溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水屮,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基屮),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一•定的约品•,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。。最后定容至1000ml,摇匀。安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3•抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。使用前要向100ml培养液中加入lml谷氨酰胺溶液(4°C时两周有效)。血清的灭活:细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在56C水浴屮灭活30分钟后,再经过抽滤方可加入培养基小使用。HEPES溶液:HEPES的化学全称位轻乙基呱嗪乙硫磺酸(N‘-a-hydroxythy1piperazine~NJ-ethanesulfanicacid)。对细胞无毒