分离组织膜蛋白的方法..doc

分离组织膜蛋白的方法: 1 )取组织适量,加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。 2) 1000g 下4℃离心 10min ,取上清液转入另一离心管中。 3) 105000g ,4℃离心 1 hr。弃去上清, 沉淀用适量的 Buffer B 重悬, 冰上孵育 2hr 后分装至 EP 管, Eppendorf 台式离心机 10000rpm ,4℃离心 30min 。 4 )收集所得上清液即为膜组份。 Buffer A: surcose , 5mM Tris-HCl ( PH ), 120mM KCl , 1mM EDTA,1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。 Buffer B: 20mM HEPES ( PH ), 10% 甘油,1% (W/V)SDS ,2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。 2 、分离膜蛋白的方法(操作) 1 )分离细胞膜蛋白的方法: 1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 A中, 于室温与液氮罐中反复冻融 2 次。 2 5000 转4 度离心,驱除核及未裂解的细胞。 3 取上清 12000 转4 度离心 10 分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B 中。 4 12000 转4 度离心 10 分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C 中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE 电泳,分装后-20 度保存备用。 buffer A: 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT, Leupeptin,20uM pmsf(PH=) buffer B: 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT, Leupeptin,20uM pmsf(PH=) 1mM EGTA buffer C: Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=), 2 )分离细胞膜蛋白的方法: 1 、细胞放在冰上,去除上清,用 pH7 。4 的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次 2 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min 3 、刮下单层细胞, 4 度下 10 000g 5min 离心 4 、溶液 37 度水浴 10min 以分离水相和去污剂相,然后 37 度下 2 000g 离心 5min 5 、收集水相留作分析 6 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污剂相沉淀,冰浴 2min 后加温,在按步骤 6 再次离心 7 、按步骤 8 再次抽提去污剂相,用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 8 、用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相,并进行免疫沉淀实验试剂: 1、 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl ( pH7 。5) 、蛋白酶抑制剂 2