市售鹿鞭的dna指纹鉴定研究.doc

市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究[摘要]目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色索b基因(Cytb)部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特界的DNA分子标记学鉴定方法。方法对市售鹿鞭进行样本处理,模板制备,采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应,对市售鹿鞭样本釆取DNA指纹鉴定。结果对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定,有二个样本为正品。结论此方法对市售鹿鞭鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行,说明鹿鞭mtDNA具有特界性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。[关键词]市售鹿鞭;线粒体DNA;DNA指纹鉴定[中图分类号][文献标识码]B[文章编号]2095-0616(2014)02-50-0320世纪80年代,由于分子分类学的出现,使人们从研究生物形态表征进入到生物的DNA遗传物质。人们可以根据DNA系列的差异来鉴定生物物种,是因为同种生物体有相同的DNA系列,不同种生物有不同DNA系列。除了矿物类药材外大多数药材是从动植物中得到,动植物药材一般从死亡的干燥生物或者其组织器官中来。随着生物体的逐渐死亡,DNA会被核酸酶大量降解,使药材中DNA的分析有一定难度。近些年,分子生物学发展速度很快,尤其是微量DM提取技术与PCR扩增技术,使从药材屮提取分析微量的DNA成为可能,也为药材进行DNA技术鉴定提供了可能。DNA分析技术使中药材和与其容易混淆品种之间如何更好地鉴定找到了一个好办法。mlDNA是遗传信息的载体,它被认为是动物起源进化的研究和分析群体遗传的最佳对象,Cytb进化速度适中,是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的DNA片段,可以应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。本研究旨在探索将DNA指纹鉴定技术应用于市售鹿鞭鉴定中,以此提高其鉴定准确性[1],共2批,抽取6个样木,编号为:1、2、3、4、5^6o干品牛鞭样木,编号为7。鹿鞭及其伪充药材均经吉林市食品药品检验所鉴定。:购自北京鼎国公司,入DNA/IIindIII:购自TIANGEN公司,DNAMarkerI:购自TIANGEN公司。:购England,dNTP及PCR缓冲液:购自北京置鼎国公司,其他常用化学试剂:国产或进口分析纯。-16G台式高速离心机:上海医用分析仪器厂,II-2050R型台式低温高速离心机:美国Beeman公司。2方法1样本的前处理将市售鹿鞭中药材6个样本及干品牛鞭的龟头及阴茎部分,用粉碎机粉碎处理,将粉碎后的干燥纤维置于4°C保存,备用。,彻底清洗后紫外照射30min,分别转入25mL离心管中,(),56°C保温72h。4000rpm4°C离心15min,倒掉上清液。加入裂解液5mL,56°C水浴中保温过夜,至组织完全消化溶解。消化液用等体积饱和酚抽提1次,等体积酚-氯仿抽提2次,氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。加入2倍体积的-20°C的无水乙醇,混匀放于冰箱中过夜。15000rpm4°C离心30min,真空干燥,溶解于TE缓冲液。