猪usf1基因克隆与序列分析.doc

猪usf1基因克隆与序列分析.doc猪USF1基因克隆与序列分析摘要:研究克隆了猪USF1基因1382bp的cDNA序列(登录号:EF219407)和5516bp的DNA序列(登录号:EF625885)。序列分析发现猪USF1基因编码区序列与人、小鼠的同源性分别为99%和98%。基因组序列分析发现猪USF1基因包含11个外显子和10个内含子,内含子的剪接方式均符合“GT-AG”法则。关键词:猪;USF1基因;克隆;序列分析中图分类号:S828;Q78文献标识码:A文章编号:0439-8114(2013)24-6175-03上游刺激因子1(Upstreamstimulatoryfactor1,USF1)是螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(IILH-LZIP)转录因子家族成员之一[1],可以与USF2形成二聚体,并能识别DNA的E-box序列,调节基因转录[2]。人类USF1基因位于Iq22-q23[3],并广泛表达于机体的各个组织,调控糖和脂肪代谢基因的表达[4],此外USF1基因还具有调节免疫反应和细胞周期的功能[5]。研究发现USF1基因可以作为调节治疗人的胰岛素抵抗葡萄糖不耐症、II型糖尿病和向心型肥胖易感症的候选基因[6-9]o本研究利用EST信息和测序的方法克隆了猪USF1基因并进行了序列分析,为进一步研究该基因对猪生长发育的调控机理具有重要的意义。(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场)的肌肉组织,用液氮速冻置于-70°C中,利用TRizol法提取总RNA,反转录得到cDNA0利用DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA,贮存于-20°CopMD~18Tvectorsystem、DH5a购自宝生物工程(大连)有限公司;GelExtractionKit购自生工生物工程(上海)股份有限公司。,利用NCBI中的BLAST工具在GenBank数据库中搜索同源序列,筛选猪的同源性EST(标准:长度>200bp,相似性380%),用DNAStar软件包中的SeqMan程序进行EST序列拼接,参照拼接的contig(重叠群),U2F/U2R,U3F/U3R等3对引物扩增USF1基因的cDNA序列。参照USF1基因的cDNA序列设计U4F/U4R,U5F/U5R,U6F/U6R,U7F/U7R,U8F/U8R,U9F/U9R等6对引物(表1)扩增USF1基因的序列。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。,包括50ng模板DNA、、>、>2UTaqDNA聚合酶。PCR反应程序为:94°C预变性4min;94笆变性45s,退火(温度、时间根据引物来确定),72°C延伸90s,35个循环;最后72°%琼脂糖凝胶电泳检测,用GelExtractionKit试剂盒纯化回收,与pMDT8Tvectorsystem连接,并转化大肠杆菌DII5a,将阳性克隆送至北京奥科生物技术有限公司测序。-PCR扩增USF1基因以大白猪cDN