大致流程:利用了硅胶膜的选择吸附的特性,结合真空或分离柱处理,是同时纯化多个样品的QIAampViralRNAMiniKit膜吸附buffer至QIAamp理想选择。先将样品在高变性条件下裂解,灭活RNase,确保病毒RNA的完整性。调节与膜结合,而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除。RNARNA的最佳条件,将样品转入QIAampMinicolumn,可以直接进行下游实验,也可储存备用。纯化产物缓冲液洗脱得到的高质量的RNA去。用特殊的Rnase-freeRNA膜就可以保证高纯,完整的核酸,其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀,QIAamp无蛋白质,Rnase污染的。的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无注意:样品如果是冷冻保存的,要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀,降低病毒效价,最终减少产1.,小心吸取上清进行实验。,离心3minQIAamp膜。若产生了沉淀,可以通过6800×g量。此外,,一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。如果起始样品量较大,超过了140ul,那么最好分几次放入分离柱。,那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。为避免此现象的发生,推荐用无细胞液体提取病毒RNA。如果样品中含有细胞,如脑脊液,骨髓,尿液等,应该先过滤,或者1500×g离心10分钟,然后取上清。如果RNA,DNA一起分离了出来,洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化,然后70℃,15min失活Dnase。,产量取决于样品大小,样品保存和病毒效价。流程推荐的起始样品量为140ul,不过280ul也是可以的。上柱前,小量的样品要用PBS调节到140ul,而低效价的样品要先行浓缩到140ul。对大于140ul的样品,上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加,但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。如果起始样品量比较多,建议将裂解样品分多次进行上柱。无需担心柱子会超载,纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过560ul时,最好先浓缩样品。需准备的东西(分离柱法):无水酒精(96%~100%);离心管;灭菌,Rnase-free枪头,离心机(适用于和2ml离心管)。试剂准备:,配成1ug/ul的溶液。充分溶解后,将其分成合适的等份,-20℃冻存。反复冻融不要多于3次。,必要的话可置于80℃温育至沉淀溶解。按照表1及公式计算一批样品所需的bufferAVL-carrierRNA混合物的体积(说明书15~16页写的比较清楚,不再详述)。轻柔的颠倒混匀10次,不要涡旋,避免产生泡沫。(Note:bufferAVL-carrierRNA应该现用现配,2~8℃可保存48小时。用)。5min℃加热不能超过80次。6℃加热重新溶解。溶解次数要小于80前,=ymlymlx10μl/ml=zμln=numberofsamplestobeprocessedsimultaneouslyy=calculatedvolumeofBufferAVLz=volumeo
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