苯丙氨酸生物合成通路多酶基因协同表达研究.pdf

分类号 TS202,Q784 学校代码 10129
U D C 606 学号 08209006
苯丙氨酸生物合成通路多酶基因协同表达研究
Studies on Coordinate Expression of Multienzyme-genes
in Phenylalanine Biosynthesis Pathway

申请人:芦佳
学科门类:工学
学科专业:食品科学
研究方向:食品生物技术
指导教师:郭军副教授
黄英武博士

论文提交日期:二〇一一年五月
摘要

苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)是人体所需的必需氨基酸,在医学、营养
学、食品加工及动物饲养领域均有应用。苯丙氨酸还是生产甜味剂阿斯巴甜
(Aspartame)的关键原料,目前市场需求日益增加。我国缺乏先进高效的 L-苯丙
氨酸(L-Phe)生产技术,主要依靠进口,因此利用分子生物学技术构建 L-苯丙氨
酸高产工程菌具有现实意义。
本研究通过设计、优化酶基因的间隔调控序列(Intergenic regulatory
sequence),使 L-Phe 生物合成代谢通路上下游的关键酶基因 pheA、aroF 和 ppsA
协同表达,从而达到提高 L-Phe 产量:⑴分别设计酶基因 pheA、aroF 和 ppsA 的
调控序列,构建单基因重组质粒,其中成功构建的重组子 pTrc-99a-pheA,
pTrc-99a-aroF 单基因酶蛋白获得高表达;⑵构建 pheA 和 aroF 酶基因串联重组
质粒 pZE12-AF,改变两个串联基因间隔调控序列后得到了重组子 pZE12-RBS-AF,
将这两个重组质粒转入营养缺陷菌 MG△pheA…aroF 中,成功构建了工程菌 MG△
pZE12-AF 和 MG△pZE12-RBS-AF;⑶构建三个酶基因 pheA、aroF 和 ppsA 串联重
组质粒 pZE12-AFP,调整 ppsA 的调控序列后的重组子 pZE12-RBS-AFP,并成功构
建相应工程菌 MG△pZE12-AFP 和 MG△pZE12-RBS-AFP。
利用 SDS-PAGE 观测酶蛋白表达量,调整多酶基因 AF 的间隔调控序列,二基
因重组质粒 pZE12-RBS-AF 的酶蛋白比 pZE12-AF 表达量高;同样,AFP 三基因重
组质粒中,pZE12-RBS-AFP 质粒调整了 ppsA 的间隔调控序列,酶蛋白比 pZE12-AFP
表达量也明显增多。测定工程菌发酵培养液上清中 L-Phe 的含量, MG △
pZE12-RBS-AF 工程菌 L-Phe 的产量比 MG△pZE12-AF 提高了 倍;MG△
pZE12-RBS-AFP 的产量比 MG△pZE12-AFP 也提高了 2 倍。MG△pZE12-RBS-AFP 菌
L-Phe 的产量是 MG△pZE12-RBS-AF 的 倍。实现了 L-Phe 生物合成中关键酶基
因 pheA、aroF 和 ppsA 协同、匹配表达,代谢流显著流向终产物 L-Phe,表明调整
串联酶基因的间隔调控序列是改变代谢流及提高 L-Phe 的产量的一种有效方法。
此外,选用低拷贝的 pZE12 质粒作为表达载体比高拷贝质粒(例如 pTrc-99a)酶
表达更适度而稳定,并不易形成包涵体和活性更高。

关键词: L-苯丙氨酸;多酶基因;间隔调控序列;协同表达;生物合成
Studies on Coordinated Expression of Multienzyme-genes
in Phenylalanine Biosynthesis Pathway

Abstract

Phenylalanine (Phe), being one of the essential amino acid, has been widely
utilized in medicine, nutrition, food and feed industry, especially, L-Phe is one of key
material for synthesis of aspartame, a sweetener utilized in mass, the market demand is
increasing. However, for lack of advanced and efficient technology for production,
L-Phe demand of our country mainly rely