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人类基因组计划
随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到xx年，以Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序(next-generationsequencing，NGS)的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。xx年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《NatGenet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。xx年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。
本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学有着指导意义。
1、第一代测序
。1977年，FrederickSanger等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。xx年，AllanMaxam和WalterGibert发明了Sanger测序法，并在此后的xx年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP，延伸便终止。每一次DNA测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。
人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如，临床上采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序TCOF1基因可以检出多达90%的与TreacherCollins综合征相关的突变。
值得注意的是，Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR直接扩增测序。单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。
因此，应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置，设计包括该点在内的上下游150~200bp的外显子片段引物。此外，尽管有NGS的出现，但Sanger测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。到目前为止，Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准，也是NGS基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。
值得注意的是，Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS。虽然Sanger测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。另外，Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。
。在NGS出现之前，国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克