小鼠胎肝干细胞经化学试剂诱导向心肌细胞方向分化研究.pdf

重庆医科大学
硕士学位论文
小鼠胎肝干细胞经化学试剂诱导向心肌细胞方向分化的研究
姓名:吴必刚
申请学位级别:硕士
专业:内科学
指导教师:张晓刚
20090601
胎肝干细胞的性质及其向类心肌细胞方向分化的研究摘要研究背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病,特别是急性心肌梗死,是严重危害人类健康的常见病,多发病。目前虽然能在发病小时内通过及时溶栓或介入治疗以挽救濒临死亡的心肌组织,但由于绝大部分患者就诊时缺血心肌已经坏死。此时再灌注治疗只能防止梗死面积的扩大,而无法挽救已经坏死的心肌。如何更有效地治疗冠心病,成为医学研究的焦点。而新近的研究结果,为患者带来了希望。传统观点认为,心肌细胞出生后即向终末分化,不能够复制,并且成年心肌组织中没有储存的心肌祖细胞,因此心肌受损后心肌细胞不能再生,被疤痕组织代替,最终导致心脏的收缩功能受损‘。然而目前很多研究结果‘给我们带来观念上的更新:其一,心脏不是终末分化器官,心肌中有%的细胞是单核细胞,,%是双核细胞,这一比例不受疾病、年龄、性别、心肌肥大及心肌缺血等影响。其二,急性心肌损伤促进心肌细胞代偿性增殖。虽然有研究显示:急性心肌梗死后也有少量心肌细胞发生分裂增生‘。但分裂的细胞数量很少,修复心肌组织的能力有限。因此,细胞移植,这一旨在增加心肌细胞数目的方法可能是有效治疗心肌损伤的最佳选择。重庆医科大学硕士研究生学位论文
型阳▲和免疫共刺激因子,能够在异种异体环境中存活,而不目前研究多集中在胚胎干细胞、骨骼肌干细胞、骨髓间充质干细胞等各类干细胞的心肌移植,并屡有移植细胞在体内存活分化,修复梗死心肌,改善心脏功能的研究报道。然而要将上述研究最终用于临床,却面临诸多问题。胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的内细胞团或桑椹胚的二倍体细胞,从植入子宫内膜前的囊胚中提取,在体外分离培养而建立的细胞系。其显著特征是可以在体外长期保持不分化状态下的增殖能力,并仍具备分化为三胚层细胞的稳定发育潜能,有“万能细胞’’之称=暧行┕乙呀獬咛ジ上赴芯康慕睿F渖ǔ松缁岷吐理方面的障碍。但获取受限和移植排斥反应是限制其发展的瓶颈。骨骼肌干细胞具有能耐受缺血环境;移植后很快分化成具有收缩性的骨骼肌等特点。但其数量极少,且与年龄增长负相关,分离纯化的技术难度大。而最大的缺陷在于骨骼肌干细胞并不能与受体心肌细胞形成闰盘连接,不能整合到受体心肌细胞中形成生理性功能合胞体,导致骨骼肌干细胞移植后往往发生心室节律紊乱,使其应用价值受到不少学者质疑。骨髓间充质干细胞具有取材方便、体外分离纯化相对简单、易扩增等特点;同时由于它们存在独特的免疫耐受性湓蚩赡苁侨狈被受体免疫系统所排斥。所以骨髓间充质干细胞是用于心肌移植的优胎肝干细胞珽墙曛鸾势细胞之一,被广泛关注重庆医科大学硕士研究生学位论文气
被关注的一类间充质干细胞细胞。有学者‘认为胚胎肝脏发育早,胎肝干细胞可能具有比骨髓干细胞更强的增殖分化能力和更低的免疫原性和免疫活性。有研究者已就其向类心肌细胞方向分化做出了初步探讨。胎肝干细胞有望用于心肌移植的优势细胞之一。研究目的:呕∈驟的分离、纯化、扩增的方法;冉喜煌龄的镅宰矗嘌〕龌竦眯∈驟的合适时期;过体外诱导分化实验了解欠窬哂蟹只@嘈募∠赴那蹦埽冉喜煌挠盏继跫拢珽向类心肌细胞方向的分化情况。第一部分:探讨小鼠掷搿⒋炕⒗┰龇椒ǎ冉喜煌龄的小鼠纳镅宰础2捎媒涸讣覧ê筒钏贴壁法分离不同胎龄的小鼠煤ビ诺忍ヅQG宓瓺嘌号嘌ü锤创ù訣进行纯化和扩增培养。结果提示:.胎龄组翁唬ぷ刺己茫上赴性明显,是相对原始的干细胞。随胎龄增加,。ü细胞标志的双显型干细胞方向过渡。结论:チ涞腅,是相对原始的干细胞,可能具有更广泛的分化潜能。ü鲜龇椒ǎ苫竦檬靠晒郏灾饰榷ǖ第二部分:探讨不同的诱导条件下,蛐募∠赴较虻姆方法与结论:重庆医科大学硕士研究生学位论文
化情况。取代细胞以/芏冉又钟谂嘌迳稀5毕赴近%.%融合时,用不同浓度的诱导剂诱导细胞缓笾糜,,%,饱和湿度的孵箱中培养。倒置显微镜下观察细胞形态变化,发现在下述条件下细胞发生了向心肌细胞方向的分化:诱导剂为%,孵育时间为嘌菏呛有%%非必需氨基酸、プ笮劝彼岬腖—培养基。培养条件是,,%,饱和湿度的孵箱。结果提示:诱导芎螅只赴市≡残危哂邢嗷ゾ奂纬汕蛐蜗赴沤峁沟趋势;诱导后第埽赴庖咦榛旧崾咀;赴泶镄募√匾性肌钙蛋白和肌动蛋白【.。结论:∈驟具有向心肌细胞方向分化的潜能;煌种属来源的细胞发生分化的时间和过程并不完全相同,转化为成熟心肌细胞所需时间也不同。总结:酶牧嫉牟钏偬诜ǎ梢源犹ジ沃蟹掷氤鼍哂辛己锰谀力的干细胞群,方法较为简单易行。チ湮男∈筇ジ危ノ恢亓康奶ジ沃泻懈嗟木哂形成集落能力的干细胞。男∈筇ジ胃上赴τ谙喽栽嫉奈捶只锥巍∈驟在虳:嫌盏嫉那榭