荧光(荧光显微镜和荧光分光光度计)学习资料.ppt

荧光技术
韩东洺
细胞生物学科
2014-11-5
1荧光和荧光素
利用较短波长的光(激发光)照射样品,使样品
受到高能量激发,产生较长波长的荧光(发射光),
用来观察和分辨样品中产生荧光的物质的成分和位
a以一标小勵岖区
同一标本,大屮
司一标本,日菱论粉
荧光原理
高能级、不稳
Stokes频移
能级
N
照明光
潋发光
荧光
(发射光)
荧光物质,探针、
低能级、稳态
染料、蛋白
2常见荧光素:
(1)异硫氰酸荧光素( fluorescein isothiocyanate,FITC)
(2)四乙基罗丹明( rhodamine,RB200)
四甲基异硫氰酸罗丹明
(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)
(4)镧系
(5)藻红蛋白(P- phycoerythrin,PE)
(6)多甲藻叶绿素蛋白( peridinin chlorophy ll protein,
PercP)
(7)碘化丙啶( propidium iodide,PI)
常用的荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱最大发射光谱
应用
异硫氰酸荧光素
90~495m520-530m(黄绿色)FAT、荧光偏振免疫测定
(FITC)
四乙基罗丹明(820570-575m595-600m(橙红色)C的衬比染色或双标
记FAT
四甲基异硫氰酸罗丹|55m
620nm(橙红色)
FITC的衬比染色或双标
明(TRIT0
记FAT
藻红蛋白(PE)
490-560m1595m(红色)
双标记FAT、流式细胞术
7-氯基一4-甲基香豆素354m
430nm(蓝色)
双标记或多标记FAT
Eu合物
340nm
613nm
时间分辨荧光免疫测定
荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物
标记酶底物荧光产物激发光m)|荧光m)|相应信号
碱性磷酸酶|4-P|4-10
半乳糖芒酶|4-1064-01361
辣根过氧化物酶|BA二聚体317
3合适荧光素的选择:
(1)具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
(2)荧光效率高,标记后下降不明显
(3)荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
(4)标记后能保持生物学活性和免疫活性。
(5)标记方法简单、快速。
(6)安全无毒
4荧光显微镜( fluorescence microscope)
荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上
些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断
滤片等)的基础上组成的。
光源
滤光片
光路
聚光器
镜头
·图像釆集系统
荧光光源:高压汞灯、氙灯或卤素灯
滤色系统
激发滤色片:置于光源与物镜之间,用于选择激发光范
围,只有能激发荧光染料发光的特定波长
的光通过。
阻挡滤色片:物镜和目镜之间,选择性通过特异的荧
光,呈现专一的荧光色彩。
光路
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
阻拦滤色器
阻拦滤色器
激发滤色器
聚光镜
分光镜
简单折光镜
物镜〔聚光镜
光源
b
透射光:照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。
落射光:照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本,经标本反
射进入物镜。