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华中科技大学
博士学位论文
蓝藻光合作用光系统 II 的蛋白质工程与调控研究
姓名:汪星
申请学位级别:博士
专业:环境工程
指导教师:赵开弘
2011-05
华中科技大学博士学位论文
摘要
利用细菌双杂交技术,研究了在 Synechocystis sp. PCC 6803 基因组中与藻胆体
核膜连接蛋白 ApcE 有相互作用的蛋白,结果发现糖基化转移酶 Sll1466 与 ApcE
有强相互作用。
将 sll1466 在 Synechocystis sp. PCC 6803 体内敲除,并对所构建的突变体
⊿sll1466 进行了生理、代谢、遗传和光合作用等方面的研究,比较其与野生型
(WT)Synechocystis sp. PCC 6803 在上述功能方面的差异。研究结果表明:sll1466
在体内是单独转录的,与其他相邻基因没有共转录现象,sll1466 的缺失不会引起
藻内的其他极性效应;在缺乏 sll1466 的⊿sll1466 中,ApcE 的转录水平明显降
低,使得藻胆体与光合作用中心的能量传递受阻,ApcE 的表达量明显降低也使得
⊿sll1466 中藻胆体与类囊体膜的衔接不及 WT 中的紧密,从而导致⊿sll1466 中
藻胆体在类囊体膜上的移动速率较 WT 快;Sll1466 的缺乏,也使得⊿sll1466 中
的聚β羟基丁酸酯和羧酶体的含量明显比 WT 中少,肝糖含量也不及 WT,导致
⊿sll1466 的生长速率低于 WT;sll1466 的缺失使得藻对光的敏感性增强,在 LL
条件下,⊿sll1466 对光的利用效率明显高于 WT,其生长速率也较 WT 高,而
⊿sll1466 对 HL 的耐受能力则不及 WT,生长速率也远不及 WT,但我们发现
Sll1466 的缺乏并不影响藻的光状态转换和光系统的电子传递,只是⊿sll1466 的
状态转换速率要较 WT 快;在对藻的不同膜组分的糖基化检测中,我们发现通常
在 WT 的细胞外膜和周质膜中起糖类转运作用的 OprB 孔蛋白 Slr1908 和
Slr1841,在⊿sll1466 中的类囊体膜上被检测出来,可见 Sll1466 对藻细胞内的糖
类运输及代谢合成起着重要的作用;在对藻的不同膜组分的磷酸化检测中,作为藻
胆体连接多肽的 CpcG1 蛋白在⊿sll1466 的类囊体膜上清中被检测出来,而在 WT
的同样组分中未被检测到,可见⊿sll1466 中的藻胆体更容易从类囊体膜上被洗脱
下来;在对类囊体膜脂质的分析中,我们惊奇的发现,⊿sll1466 中 DGDG 的含量
较 WT 中有明显降低,该不饱和脂肪酸含量的显著降低,也是促使⊿sll1466 中藻
胆体与光合作用中心的能量传递受阻、对 HL 及高温的耐受能力不及 WT、藻胆
体在类囊体膜上的移动速率较 WT 快的重要因素;在缺乏 Sll1466 的条件下,藻
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2- 2+
对 BG11 中的一些离子和必要元素的需求量降低,其中以 CO3 、 Cu 缺乏的培
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养条件尤为明显,从在缺乏 CO3 的条件下⊿sll1466 的生长速率高于 WT 我们推
断⊿sll1466 固定 CO2 的能力比 WT 强。
在对 Anabaena sp. PCC 7120 的别藻蓝蛋白 ApcE 与 ApcF 的体内重组光谱及细
菌双杂交验证两者相互作用的研究中,我们发现:在提纯前,PCB-ApcE/PCB-ApcF
的吸收及荧光光谱峰与 PCB-ApcF 的峰位置一致,而提纯后,PCB-ApcE/PCB-ApcF
的吸收及荧光光谱峰与 PCB-ApcE 的峰位置一致,表明 ApcE 与 ApcF 不能形成复
合物。pBT-apcF 与 pTRG-apcE 的共转化细胞能在无 3-氨基-1,2,4 三氮唑( 3-AT )
的非选择性培养基上的生长,而不能在有 3-AT 的选择性培养基上生长,说明在转
化过程中未产生能抗 3-AT 的 HIS3 报告基因,进一步证实 ApcE 与 ApcF 间没有相
互作用。
在对 Anabaena sp. PCC 7120 藻胆体核亚基 ApcD 结合色素 PCB 的体内重组中,
发现色素蛋白在提纯前后最大吸收和荧光峰发生了红移,从提纯前的 605nm 及
633nm 变为提纯后的 650nm 及 665nm。为了研究该现象的原因,构建了 ApcD 的八
个突变体,重组结果显示:突变体 ApcD ( Y88I ) 色素蛋白在提纯后的吸收和荧光
光谱较提纯前均多出一个峰,分别为 668nm 和 690n