探针分类
依据化学组成, 能够将探针分为DNA、 RNA、 PNA及寡核苷酸探针。
DNA探针 这类探针应用最广, 能够经过化学合成、 克隆或PCR技术取得。
RNA探针 通常见RNA聚合酶体外转录克隆DNA序列取得。 RNA-RNA杂交分子在全部可能杂交分子中最稳定, 但RNA探针轻易被RNase降解。
肽核苷酸(PNA)探针 PNA寡聚物是一类新分子, 其结构和DNA相同。 但在PNA中, 没有核糖-磷酸基骨架, 其骨架是不带电肽链(聚酰胺)
寡核苷酸探针 它是依据探针靶序列碱基次序用化学方法合成单链DNA, 其长度为15-20核苷酸。 因为分子小, 所以更轻易渗透到细胞目标区域; 但也正因为分子小, 限制了其所能携带荧光基团或汇报分子数目, 并最终造成杂交后荧光信号较弱。 所以这类探针仅实用于对反复单位较短高度反复序列荧光原位杂交分析
DNA纯化方法
假如样品中残留盐和SDS浓度过高: 酒精/NaAc沉淀, 70%酒精洗
假如样品中残留RNA过多: RNA酶37C半小时, 酚/氯仿去除RNA酶
假如样品中残留蛋白质、 酚过多: 酚/氯仿去除
DNA浓度测定
紫外分光法:
1 OD260 = 50 g / mL ds DNA(双链)
= 40 g / mL ssDNA / RN(单链)
计算举例:
15 μL DNA原液稀释至3 ml (200倍), 测得OD260 = , 则
[DNA] = ×50 ×200 = 2370 μg / mL = μg / μL
点样法:
1 μL浓度未知样品和1 μL已知浓度标准品或上次试验结果不错剩下DNA样品分别和9 μL溴乙锭(10 mg / mL)混合, 紫外灯下目测二者浓度差异, 据此调整样品浓度后, 再点样观察, 直至二者浓度基础一致。
高通量测序技术应用
重头测序(de novo sequencing)
重测序(resequencing)
全转录组测序(whole transcriptome resequencing)
小分子RNA测序(small RNA sequencing)
染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)
DNA检测应用
新药研发 、 个性化基因诊疗 、 癌症诊疗、 产前诊疗 、 司法判定、 食品安全 、 农牧业研究 、 环境保护、 国防和军事
DNA双螺旋结构模型关键点:
①DNA分子由两条相互平行但走向相反脱氧多核苷酸链组成, 两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架, 以右手螺旋方法绕同一公共轴盘。 螺旋直径为2nm, 形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)相间。
②碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側, 和对側碱基形成氢键配对(互补配对形式: A=T; G C)
③, , 一圈10对碱基。
重组DNA技术基础原理及步骤
①目标基因获取
②基因载体选择和构建
③目标基因和载体拼接
④重组DNA分子导入受体细胞
⑤筛选并无性繁
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