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蛋白质提取、 纯化及分析技术（适应于微生物、 生化等专业）
试验一 多酚氧化酶（PPO）分离提取
一、 原理和目标
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在一个含铜氧化酶, 植物受到机械损伤和病菌侵染后, PPO催化酚和O2氧化形成醌, 是组织形成褐变, 方便损伤恢复, 预防或降低感染, 提升抗病能力。 醌类物质对微生物有毒害作用, 所以伤口醌类物质出现是植物预防伤口感染愈伤反应, 所以受伤组织通常这种酶活性就会提升。 多酚氧化酶也可和细胞内其它底物氧化相偶联, 起到末端氧化酶作用。
PPO存在是水果、 蔬菜褐变及营养丧失关键原因之一。 PPO氧化内源酚类物质生成邻醌, 邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、 氨基酸等作用生成高分子络合物而造成褐色素生成, 色素分子量愈高, 颜色愈暗。 多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠指标之一。
本试验将采取马铃薯为关键材料, 经过组织细胞破碎匀浆、 过滤、 离心、 硫酸铵沉淀、 透析等步骤取得PPO粗酶液。
经过本项试验, 学习和了解蛋白质提取、 分离基础原理和方法, 掌握相关仪器设备操作使用, 和蛋白质提取、 分离系统技术。
二、 材料和试剂
（1）马铃薯（大约每小组100-200g）
（2）试剂:
(, , 5%甘油, 1%聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍浓缩液1000ml; 固体硫酸铵; （, , ）配置时配
（3）试验器械和仪器设备:
试管和试管架; 烧杯、 玻璃搅棒; 移液管、 滴管等; 试剂瓶; 透析袋;
过滤纱布; 植物组织匀浆器; pH计和pH试纸; GL-20C高速冷冻离心机;
DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、 操作步骤
1: 粗酶提取:
水果肉组织按1: 1（W/V）（, , 5%甘油, 1%聚乙烯吡咯烷酮）混合, 匀浆4层后纱布过滤, 滤液以6000rpm离心10min, 弃除沉淀取得酶提取液。
2: 盐析分级沉淀:
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达成40%饱和度（边加边搅拌达成充足溶解）, 然后6000rpm离心20min弃除沉淀; 离心上清液在加入固体硫酸铵达成70%饱和度（边加边搅拌达成充足溶解）, 再以6000rpm离心20min, 弃除上清夜, 搜集粗酶沉淀。
四、 试验结果
取得PPO粗酶液。
试验二 PPO粗酶液纯化
一、 原理
G-200凝胶柱层析 利用大分子不能进入凝胶颗粒内部 最先流出柱外, 而小分子物质进入凝胶颗粒内部, 流速慢而最终流出柱外, 凝胶层析法能将不一样分子大小物质分离开。 （G-200能分离800-80000D分子量蛋白质）
, 选择DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料, 因为PPO是带有阳离子蛋白质, 在层析时会吸附在柱材料上, 而杂蛋白会洗下。 后用NaCl梯度洗脱PPO, （NaCl为强离子交换剂, 能将弱吸附在柱材料上PPO置换下来）。 粗酶液从而得到纯化。
二、 材料和试剂
试剂: Tris-( EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇; DEAE-纤维素DE52; 葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖－40、 70、 100等;
试验器械和仪器设备: 试管和试管架、 烧杯、 玻璃搅棒、 移液管、 滴管等; 试剂瓶、 层析柱、 pH计和pH试纸、 恒流泵、 梯度混合仪、 核酸蛋白监测仪、 GL-20C高速冷冻离心机、 DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、 操作步骤
1．葡聚糖凝胶处理、 装柱及平衡
（1）柱材处理
称取一定量Sephadex G-200干粉, 加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮细微颗粒, 为预防凝胶颗粒中空气存在, 影响层析效果, 凝胶装柱前一定要将凝胶液中气体除掉, 其措施是将凝胶液放进抽滤瓶中, 进行抽真空处理, 直到凝胶液中没有气泡出现为止。
（2）装柱
将层析柱清洗洁净垂直固定到层析架上, 加1/3体积无离子水, 打开下出液口, 水流通畅, 立即将小烧杯中装有适宜浓度凝胶液（凝胶浓度过高会产生气泡, 影响蛋白质分离速度, 浓度过低易产生凝胶分层, 影响蛋白质分离效果）轻轻倒入层析柱中, 凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部, -2cm处, 停止装柱, 剪一和柱内径相等滤纸片覆盖于凝胶上。