SOD提取纯化.doc

动物血中超氧化物歧化酶提取和纯化
一、 超氧化物歧化酶提取
[原理]
l969年, McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD分布极广, 其含量随生物体不一样而不一样, 即使同一个生物不一样组织或同一组织不一样部位, 其SOD种类和含量也有很大差异。 迄今为止大家已从细菌, 真菌、 原生动物。 藻类、 昆虫、 鱼类、 植物和动物等多种生物体内分离得到SOD。 为拓宽提取SOD原料, 筛选或基因过程开发产SOD量较高菌株。 现在, 研究开发最多资源还是从动物血液、 动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个关键步骤:
（1）原材料预处理;
（2）粗酶液制备;
（3）离子交换柱层析精制。
中国多采取Mccord和Fridovich法, 其关键工艺过程为:
第一步, 乙醇-氯仿除去血红蛋白;
第二步, 有机溶剂和硫酸铵分级沉淀;
第三步, 离子交换柱层析精制。
[试剂和器材]
1、 试剂
%（质量分数）柠檬酸三钠; %（质量分数）氯化钠 ; 95%（体积分数）乙醇; 氯仿; 丙酮 ; 、 K2HPO4-KH2PO4缓冲液 ; DEAE-Sephadex A-50
2、 器材
猪血; 恒温水浴 ; 离心机 ; 布氏漏斗; 抽滤瓶; 烧杯、 量筒、 搅棒等; 透析袋
[方法和步骤]
1、 从猪血中提取SOD
（1）分离血球
取新鲜猪血, %柠檬酸三钠抗凝液中, 新鲜猪血和抗凝液百分比为3: 1, 轻轻搅拌均匀, 4 000r/min离心20min, 搜集红血球。
（2）除血红蛋白
红血球用3倍体积生理盐水洗涤, 4 000r/min离心20min, 反复三次, 然后向洗净红血球加入1～, 搅拌溶血30min, %, 猛烈搅拌15min左右, 静置1h, 然后4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀, 取清液, 过滤, 搜集滤液（统计体积, 测酶活性和蛋白浓度）。
（3）热变性
上清液加热到65℃, 保温10min, 然后快速冷却到室温, 3 000r/min离心20min, 弃去沉淀物, 搜集上清液（统计体积, 测酶活性和蛋白浓度）。
（4）沉淀
清液在盐冰浴中冷却, 然后在-5℃以下操作温度下, , 边加边搅拌均匀, 即有白色沉淀产生, 静置2～3min, 快速抽滤, 弃去滤液得肉色沉淀。 沉淀物用少许蒸馏水溶解, 4 000r/min离心20min, 除去不溶物,
K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析, 即得粗SOD溶液（统计体积, 测酶活性和蛋白浓度）。
二、 离子交换层析纯化超氧化物歧化酶
[原理]
本试验利用超氧化物歧化酶解离性质, 在