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广东药学院
硕士学位论文
二棕榈酰磷脂酸抗肿瘤血管形成及其作用机制的研究
姓名:张敏
申请学位级别:硕士
专业:病原生物学
指导教师:耿建国; 王丽京
2011-05
广东药学院硕士研究生学位论文
二棕榈酰磷脂酸抗肿瘤血管形成及作用机制的研究

学生张敏(病原生物学)
导师耿建国(教授)王丽京(教授)
中文摘要
背景与目的:
在肿瘤的发生过程中,肿瘤血管生成对原发肿瘤的生长和增殖必不可少,同
时对肿瘤的侵袭、转移亦起着重要作用。目前,以肿瘤血管生成为靶点,开发血
管生成抑制药在抗肿瘤研究中已成为一个新的十分活跃的研究领域:通过抑制、
阻断肿瘤新生血管形成,从而阻止肿瘤的生长、转移,甚至导致肿瘤细胞的凋亡,
达到治疗肿瘤的目的。在抗肿瘤血管形成药物的开发过程中,通过药物筛选模型
筛选出对血管形成有抑制或促进作用药物,对药物的开发至关重要。利用鸡胚绒
毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)和卵黄囊膜(yolk sac
membrane,YSM)筛选模型,B Known Bioactives Library(480种)中
发现二棕榈酰磷脂酸(Dipalmitoyl Phosphatidic Acid, DPPA)能抑制鸡胚绒毛尿囊
膜和卵黄囊膜血管的形成,可能作为一种潜在的抗血管形成的活性物质。DPPA
是一种机体脂质代谢中的中间产物,主要是磷脂酶D1水解作用产生。现已知其
在调节Raf-1转位和MAP激酶级联反应2和3的活化过程中起作用,其抗肿瘤作用
的研究尚未见报道。那么,既然DPPA能够抑制鸡胚血管的形成,那么它能不能
抑制肿瘤血管的形成,从而抑制肿瘤的发生、发展和转移呢?为回答这个问
题,本课题采用C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠作为肿瘤动物模型、人脐静脉血管
内皮细胞(HUVECs)为细胞生物学研究体系,探究DPPA对肿瘤血管形成、肿
瘤生长的影响,并进一步研究抑制其血管形成的作用机制。


I
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方法:
1. 建立药物筛选模型,B Known Bioactives Library进行筛选
建立 CAM 和 YSM 模型。先通过 CAM 模型,初步筛选出对血管形成有抑
制作用的化合物;然后利用 YSM 模型,进一步对筛选出的化合物进行精筛,通
过对 YSM 血管面积和血管密度的统计分析,确定其抑制血管形成的作用。
2. DPPA对移植瘤小鼠肿瘤生长的影响
建立 B16 黑色素瘤及 4T1 乳腺癌皮下移植瘤模型,用 DPPA 治疗,通过测
量肿瘤的体积、肿瘤重量,检测肿瘤体积内细胞增殖和血管微密度,探讨 DPPA
对肿瘤生长的作用。
3. DPPA的上游PLD1在肿瘤发生过程中血管内皮细胞上的表达
通过免疫荧光实验,检测肿瘤发展过程的前期和后期 DPPA 的上游磷脂酶
D1 在血管内皮细胞上的表达变化。
4. DPPA在细胞水平上对HUVECs增殖、迁移、成管能力的影响
分离并培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)。采用 MTT 法、Magrition
Assay、Tube Formation Assay,检测 DPPA 对内皮细胞增殖、迁移、成管能力的
影响。
5. DPPA抑制血管形成分子机制的研究
利用 Real-Time RT PCR 技术检测血管生长因子和血管生长抑制因子及其它
相关基因在 mRNA 水平的变化,还将进一步通过 Western Blot 技术检测相关变
化基因 ANGPT1 在蛋白水平上的相应变化,探讨 DPPA 对肿瘤作用的分子机制。

结果:
1. 通过 CAM 模型初筛和 YSM 模型精筛,对 480 种化合物库进行了大规模筛
选,我们发现 DPPA 能够明显抑制鸡胚血管形成,通过统计分析发现,DPPA
能明显抑制血管面积的增长。
2. 小鼠移植瘤模型表明,DPPA 能够抑制肿瘤的生长,实验组肿瘤体积和重量
II
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明显小于对照组;免疫组化结果显示实验组肿瘤微血管密度(MVD)及癌细
胞增殖数目明显少于对照组。
3. 免疫荧光结果显示,PLD1 在血管内皮细胞上的表达,早期表达多,后期表
达少,表明随着肿瘤的发展,PLD1 在血管内皮细胞上的表达是下调的。
4. MTT 结果显示,不同浓度的 DPPA 对 B16 黑色素瘤细胞和 4T1 乳腺癌细胞
的增殖没有抑制作用。同时, DPPA 对 HUVECs 的迁移和成管能力具有抑制
作用。
5. Re