华癸中慢生根瘤菌ctrA突变体构建及其宿主互作蛋白初步筛选.pfg.pdf.pdf

华中农业大学硕士学位论文华癸中慢生根瘤菌ctrA突变体构建及其宿主互作蛋白初步筛选姓名:刘流申请学位级别:硕士专业:微生物学指导教师:李友国 201206 华癸中慢生根瘤菌etrA突变体构建及其宿主互作蛋白初步筛选摘要 ctrA在0【-变形细菌中普遍存在,是细菌分裂周期和不对称分化的调控因子,在双组分调控系统中充当应答调节子。类菌体的发育也涉及到根瘤菌的分裂分化过程, 分析认为ctrA基因可能参与根瘤茵类菌体分化或共生固氮,亦可能接受宿主植物来源的控制作用。但是相关的研究报道和文献很少。本实验通过构建同源双交换置换载体pJQ200SK-ctrA,试图直接筛选华癸中慢生根瘤菌7653RctrA基因插入失活突变体。但是一直未能获得预期的突变体,考虑到ctrA基因可能存在突变致死性,本研究调整了筛选路线和策略,重新构建了ctrA ,为后续筛选目标突变体奠定了基础条件。另外一方面,通过构建组成型表达载体pBBR-ctrA,通过接合转移技术,将额外拷贝的ctrA引入华癸根瘤菌7653R中,观察根瘤菌自生条件和共生条件下的生长情况。结果发现其不影响7653R在白生培养时的生长;但是其共生表型为结瘤数量减少、固氮酶活性有所降低。荧光定量PCR检测ctrA表达量,结果表明:ctrA在自生和共生条件下呈组成型表达特点,且在不同时期根瘤中其表达水平差异不明显。引入额外组成型拷贝ctrA可导致根瘤中的表达量稍增强。同时,以构建pGBKT7一ctrA质粒作为诱饵,通过酵母双杂交技术,。最终结果获得4个阳性克隆,其中包括一个JUN激酶激活域结合蛋白。最后,基于ctrAbox序列的保守性,本文对于华癸根瘤菌7653R基因组中可能接受CtrA调控的基因进行搜索和分析。结果得到64个可能受CtrA调控的基因。其中发现一个新现象,CtrA可能调控7653R中结瘤固氮相关功能基因的表达,例如 opa22,minCD,fisZ等。以上结果为后期深入探究ctrA在类菌体分化、固氦及菌植互作中的功能及调控, 提供了一定的工作基础和新线索。关键词:华癸根瘤菌;曲A;突变筛选;互作蛋白;调控基因预测华中农业大学2012届硕士研究生学位论文 Abstract ThectrAgene exitsinalpha-proteobactcda ’S aregulatory factorfor thecell-cycleprogression and thegeneration ofasymmetry,and acts as aresponse regulator皿R).The growth ofbactcrioid involves rhizobium’S celldivisionand considered that ctrA may takes part inrhizobium bacterioid differentiation orsymbiotic nitrogen fixation,or even proberboly being interactivewith possible unknown protein ofthe hostplant,but the relevant studiesand literatures a聆 quite few. Inthiswork,firstly,we tried toconstruct Mesorhizobium hualaaictrA·inactivated mutant by constructing homologucs replacement plasmid pJQ200SK-ctrA,but unfortunately,we did notobtaintheexpected thatthe ctrAgene might beindispensible fortheliving ofrhizobia 7653R,the mutant would not be screened out directly,SO we changed the approach to reconstruct the ctrA low-level-expression plasmid pHN·ctrA andanother double-cross replacement plasmid, thesetwoconstructs havelaid afoundmentary basisforthe furtherscreening ofthetarget mut