土壤蛋白酶测定.doc

土壤蛋白酶测定(加勒斯江法)
1. 分析意义
蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化。它们的水解产物是高等植物的氮源之一。土壤蛋白酶在剖面中的分布与蔗糖酶相似,酶活性随剖面深度而减弱。并与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
2. 试验原理
蛋白酶能酶促蛋白物质水解成肽,肽进一步水解成氨基酸。
测定土壤蛋白酶常用的方法是比色法,根据蛋白酶酶促蛋白质产物-氨基酸与某些物质(如铜盐蓝色络合物或茚三酮等)生成带颜色络合物。依溶液颜色深浅程度与氨基酸含量的关系,求出氨基酸量,以表示蛋白酶活性。
3. 试验步骤
取2g过1mm筛的风干土置于50mL容量瓶中,加入10mL 1%(作为抑菌剂抑制微生物活动);在30℃恒温箱中培养24h;培养结束后,将瓶中内容物过滤;取5mL滤液置于试管中, 20%硫酸钠以沉淀蛋白质,然后滤入50mL容量瓶,并加入1mL 2%茚三酮溶液;将混合物仔细摇荡,并在煮沸的水浴中加热10min;将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线;最后在560nm处进行比色。
用干热灭菌的土壤和不含土壤的基质(如石英砂)作对照,方法如前所述,以除掉土壤原有的氨基酸引起的误差。换算成甘氨酸的量,根据用甘氨酸标液制取的标准曲线查知。
4. 试剂配制
a. 1%白明胶溶液();
b. 甲苯;
c. 磷酸盐缓冲液();
d. H2SO4;
e. 20% Na2SO4;
f. 2%茚三酮溶液:将2g茚三酮溶于100mL丙酮,然后将95mL该溶液与1mL CH3COOH和4mL水混合制成工作液(该工作液不稳定,只能在使用前配制);
g. 甘氨酸标准液:浓度为1mL含100μg甘氨酸的水溶液:。再将该标液稀释10倍得10
μg甘氨酸•1mL-1溶液的甘氨酸工作液。
标准曲线绘制:分别吸取0、1