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实验技术路线
技术路线
实验技术路线
双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：
明场下对脊髓定位，利用双光子强激光对脊髓进行深度扫描切割损伤
5小时后通过行为学软件分析损伤后的运动能力，判断损伤程度
对损伤后的斑马鱼进行解剖，观察扫描处的脊髓及周围组织的损伤情况
14dpf 幼年斑马鱼
%MS222麻醉
同时在损伤位点以下2mm注射反向示踪剂生物胞素
12小时后做纵切切片，利用生物胞素抗体做免疫染色
判断损伤的位置与大小是否与符合
判断胶质斑痕的位置与大小是否符合
12小时后做纵切切片，利用GAFP抗体和纤连蛋白抗体做免疫染色
实验技术路线
前期实验：
手术建模：
手术组（n=68）
假手术组（n=68）
建模成功性分析：每周分析术后运动能力，连续跟踪7周
基因芯片分析：
提总RNA
分析全部基因的表达水平，统计分析各个基因表达变化
定量PCR：
提总RNA
反转录
检测sema4e和plxnd1 相对内参GADPH表达水平的变化
原位杂交：
制作切片
制作探针
检测sema4e和plxnd1 mRNA的表达水平变化及表达细胞
Westen Bolt：
提总蛋白
检测sema4e和plxnd1蛋白表达水平的变化
取脊髓（损伤位点以下1cm）：
术后4hour, 12hour, 6day, 11day组
实验技术路线
sema4e与plxnd1关系研究：
sema4e活性片段DNA的扩增
sema4e特异性肽段的设计与合成
sema4e表达载体的构建
表达载体的导入
转染细胞的筛选与培养
表达蛋白的提取
表达蛋白的活性检测
sema4e免疫磁珠的制作
sema4e与plxnd1
免疫共沉淀
噬菌体展示技术淘选抗体
ELISA检测抗体活性
ELISA检测抗体专一性
sema4e与plxnd1
免疫共定位
实验技术路线
sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：
实验技术路线
前期结果
实验技术路线
Before lesion
Red: sham operation (n=10)
Blue: operation (n=10)
图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化
实验技术路线
Real time PCR
time points
change folds
实验技术路线
10X
10X
10X
10X
10X
anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day
10X
10X
10X
anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day
sema4e:
plxnd1:
10X
10X
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