实验技术路线.pptx

技术路线
双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：
明场下对脊髓定位，利用双光子强激光对脊髓进行深度扫描切割损伤
5小时后通过行为学软件分析损伤后的运动能力，判断损伤程度
对损伤后的斑马鱼进行解剖，观察扫描处的脊髓及周围组织的损伤情况
14dpf 幼年斑马鱼
%MS222麻醉
同时在损伤位点以下2mm注射反向示踪剂生物胞素
12小时后做纵切切片，利用生物胞素抗体做免疫染色
判断损伤的位置与大小是否与符合
判断胶质斑痕的位置与大小是否符合
12小时后做纵切切片，利用GAFP抗体和纤连蛋白抗体做免疫染色
前期实验：
手术建模：
手术组（n=68）
假手术组（n=68）
建模成功性分析：每周分析术后运动能力，连续跟踪7周
基因芯片分析：
提总RNA
分析全部基因的表达水平，统计分析各个基因表达变化
定量PCR：
提总RNA
反转录
检测sema4e和plxnd1 相对内参GADPH表达水平的变化
原位杂交：
制作切片
制作探针
检测sema4e和plxnd1 mRNA的表达水平变化及表达细胞
Westen Bolt：
提总蛋白
检测sema4e和plxnd1蛋白表达水平的变化
取脊髓（损伤位点以下1cm）：
术后4hour, 12hour, 6day, 11day组
sema4e与plxnd1关系研究：
sema4e活性片段DNA的扩增
sema4e特异性肽段的设计与合成
sema4e表达载体的构建
表达载体的导入
转染细胞的筛选与培养
表达蛋白的提取
表达蛋白的活性检测
sema4e免疫磁珠的制作
sema4e与plxnd1
免疫共沉淀
噬菌体展示技术淘选抗体
ELISA检测抗体活性
ELISA检测抗体专一性
sema4e与plxnd1
免疫共定位
sema4e与plxnd1在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：
细胞水平
转染的仓鼠肾细胞与神经元共培养,观察轴突生长情况，并通过相应抗议抑制sema4e与plxnd1可能的相互作用后观察轴突生长情况
转染的仓鼠肾细胞与血管内皮细胞共培养，观察血管内皮细胞增殖情况，并通过相应抗议抑制sema4e与plxnd1可能的相互作用后观察血管内皮细胞的增殖情况
组织水平
损伤6周后做神经轴突反向追踪，观察轴突生长通过损伤面情况
损伤6周后，做组织切片，血管免疫染色，统计损伤处的血管密度
活体水平
损伤6周后，于第一次损伤位点以下5mm显微注射示踪剂Alexa Fluor Red Dextran,12小时后活体观察神经元轴突的生长通过损伤面情况
损伤6周后，活体观察在血管内皮细胞内表达GFP的转基因斑马鱼的脊髓损伤处血管密度
整体水平
手术后给sema4e; plxnd1; control morpholino. 6周后做运动能力分析，统计比较修复速度
前期结果
Before lesion
Red: sham operation (n=10)
Blue: operation (n=10)
图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化
Real time PCR
time points
change folds
10X
10X
10X
10X
10X
anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day
10X
10X
10X
anti-sense probes sham 4hour 12hour 11day
sema4e:
plxnd1:
10X
10X
通过双光子显微镜活体观察斑马鱼脊髓内的血管