实验设计及技术路线.doc

竞赛设计及技术路线 ——软腐害,在前期课题组研究植物生物防治和保护的基础上,选取南方红豆杉为研究材料,通过对南方红豆杉内生菌进行分离和纯化,进一步通过拮抗实验,探索其对半夏软腐病菌、白菜软腐病菌、番茄软腐病菌等植物软腐病菌的抑制效果,以期为半夏等中药材、白菜等农作物等植物软腐病的生物防治提供优良的菌株材料,从而为植物的绿色、安全、健康生长提供理论和技术支撑。 ,作为植物资源库中的一株奇葩,在材质、药用等方面起着非常重要的作用,鉴于其富产紫杉醇等多种药用活性物质的优点,本课题旨在将南方红豆杉资源进一步优化利用,深入挖掘其在抗菌性、抗病性等方面的潜在价值。植物内生菌,作为一种新型微生物资源,目前受到了广泛的关注,从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点,近年来已发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。本文主要以南方红豆杉为研究对象,研究其内生菌的多样性,并从中分离出对植物软腐病菌具有抑制作用的拮抗菌株,以进一步加强南方红豆杉植株内生菌的菌种研究,深化对植物软腐病的防治作用研究, 并为生物防治菌剂的开发和研制积累理论基础。为深入研究植物软腐病的生物防治机理奠定基础,为南方红豆杉的资源应用开辟新的途径。 实验方案 样品采集南方红豆杉植株采集时间为 2012 年 5月至 8月, 采集于浙江省金华市婺城区南部山区,选取 1-3 块代表性种植地,采用五点采样法,采集南方红豆杉整个植株,每点 5株,分别采取南方红豆杉的根、茎、叶,存入牛皮纸带,做好记录, 立即带回实验室进行内生菌的分离。 样品处理及消毒 表面消毒取采集的南方红豆杉植株根、茎、叶, 用自来水充分冲洗后, 分装在三个平板上, 移至已灭好菌的超净台上,点燃酒精灯,用酒精擦拭手,首先将根用无菌水冲洗 2 次, 再移至 70% 乙醇浸泡 20S , 再用 2% 次氯酸钠浸泡 2min , 无菌水冲洗 3次。保留最后两次冲洗液,取最后一次冲洗液适量于 NA 培养基中,进行涂布,完成后注明标记。取根的最后第二次冲洗液将茎进行第一次冲洗,最后一次的冲洗液进行茎的第二次冲洗,依次进行上述操作。 消毒效果验证采用 2种方法验证样品表面消毒效果:①组织印迹法:将以上消毒后的样品, 贴放于 NA 培养基表面 5min 后,将培养皿于 30℃培养 3-5 天,观察微生物生长情况。②消毒液涂板法:将表面消毒的最后一次冲洗液涂布于 NA平板上,于30 ℃培养 3-5 天,观察微生物生长情况。如果有菌生长,表明表面消毒不彻底。两种检测方法均证明以上样品处理和消毒方法可行。 内生菌分离 内生细菌、放线菌分离: 样品表面消毒、晾干后转入加有 9mL 无菌水无菌研钵中研磨匀浆,取原液、稀释 10倍液和 100 倍液,然后分别涂于 NA/ 高氏 1 号平板上,每个稀释度设 3个重复,平板倒置在 28℃的培养箱内培养。细菌培养 24h ,放线菌培养 7-10d 。 内生真菌分离:在无菌操作台上将消毒后的材料用无菌刀切成小块,茎、根:长度 2cm 左右,等距离均匀放置于含有链霉素浓度为 30mg/L 的PDA 平板培养基上