实验二 总糖和还原糖的测定.ppt

实验二总糖和还原糖的测定(3,5~二硝基水杨酸法) 《食品生物化学实验》课程 1 ?掌握 3,5~二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理,学会处理 721 型或 722 型分光光度计出现的问题一、实验目的 2二、实验原理?还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类,单糖都是还原糖, 双糖和多糖不一定是还原糖,其中乳糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。?利用糖的溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,对没有还原性的双糖和多糖,可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定,再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。 3 ?本实验是利用 3,5~二硝基水杨酸溶液( DNS 法)与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系,可用于比色测定。操作简便,快速,杂质干扰较少。 4三、实验步骤 1、葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准液的配制:准确称取 100mg 分析纯的无水葡萄糖(预先在 105 ℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解后,定量转移到 100ml 容量瓶中,再定容到刻度,摇匀。浓度为 1mg/ml 。 5 取7支25× 250mm 的试管,分别按下表加入试剂: 管号0123456 葡萄糖标准液( ml ) 相当于葡萄糖量(mg) 蒸馏水( ml ) 3,5 二硝基水杨酸(ml) 将各管溶液混合均匀,沸水浴加热 5min ,取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入 蒸馏水, 摇匀。于 520nm 波长处测定 OD 值。以葡萄糖毫克数为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。 6 ?2、样品中总糖和还原糖含量的测定?(1)样品中还原糖的提取: ?准确称取 10g 新鲜材料(或 2g材料干样粉末),放在 100ml 烧杯中,先以少量水调成糊状,然后加 50~ 60ml 蒸馏水,于 50℃恒温水浴中保温 20min ,过滤,将滤液收集在 100ml 容量瓶中,再定容至 100ml 。 7 ?(2)样品中总糖的水解提取: ?准确称取 10g 新鲜材料(或 1g材料干样粉末),放在锥形瓶中,加入 10ml 6 mol ? L-1 盐酸, 15ml 水,在沸水浴中加热 30min ,取出一、二滴置于白瓷板上,加 1滴碘~碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。冷却后加入 1滴酚酞指示剂,以 10% 氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色,过滤并定容到 100ml 。再精确吸取上述溶液 10ml 于 100ml 容量瓶中,定容至刻度,混匀备用。 8 (3)样品中糖含量的测定: 取7支25× 250mm 试管分别按下表加入试剂: 管号空白还原糖总糖 0123123 样品溶液( ml ) 蒸馏水( ml ) 3,5 二硝基水杨酸(ml) OD 加完试剂后,与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。 9四、实验结果在 Excel 绘制葡萄糖标准曲线,并求出标准线性方程。以表格形式列出实验数据,取样品的 OD 520 平均值用标准线性方程求出相应的糖量,并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。还原糖( mg ?g -1)= 还原糖毫克数×提取液总体积( ml )×稀释倍数测定用提取液体积( ml )×样品重量( g) 总糖( mg ?g -1)= 样品水解后还原糖毫克数×提取液总体积( ml )×稀释倍数测定用提取液体积( ml )×样品重量( g) 10