蛋白质定量测定——.ppt

蛋白质定量测定——微量凯氏定氮法
目的
(1) 学习微量凯氏定氮法的原理
(2) 掌握微量凯氏定氮法的操作
原理
天然的含氮有机化合物用浓硫酸消化时分解出氨,氨与硫酸化合生成硫酸铵。这个反应速度很慢,需加入硫酸铜做催化剂,加入硫酸钾提高消化液的沸点。
消化后,加入强碱碱化消化液使硫酸铵分解,放出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入过量标准无机酸溶液中,再用标准碱溶液进行滴定,测定氨量,从而计算出含氮量。
蛋白质的平均含氮量为16%,,由凯氏定氮法测出含氮量,。
操作方法
1 样品的准备
称取牛血清蛋白50mg,加入凯氏烧瓶,-硫酸铜混合物,再加5mL浓硫酸.
2 消化
,,蒸汽和二氧化硫也均匀放出时,将功率调低,使液体微沸,消化液在轻度回流下维持2~3小时,待消化液变成褐色后,为加速消化,可取下烧杯,稍冷,将30%过氧化氢溶液1~2滴,再继续消化,直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色,消化即结束.
3 蒸馏
(1)凯氏蒸馏器的洗涤
取5个50mL的锥形瓶,各加50mL2%硼酸
指示剂混合液(呈紫红色),,使冷水流入蒸汽发生器球体2/3后关闭夹7。将电炉放在发生器2下面加热,此时夹子3和8处于关闭状态。蒸汽通过反应室1到冷凝器4外腔,凝成水滴落于盛混合液的三角瓶9中。如此用蒸汽洗涤反应室约10min后,移去三角瓶,放上另一个盛混合液的三角瓶,将瓶倾斜,以保证冷凝管末端连接的小管完全浸于液体中,继续蒸馏1-2min。观察三角瓶内溶液是否变色,如不变成鲜绿色,而是变成灰色或暗色,则表明反应室内部已清洗干净。移动三角瓶使混合液离开管口约1cm,继续通气1min,最后用水冲洗管外口,移开电炉,准备下一步把消化液加入反应室内。
(2)消化样品及空白的蒸馏
将冷却后的消化液加水稀释到刻度(50mL)
,摇匀备用。打开夹子8,放掉蒸汽发生器中的热水,然后关闭夹子8,打开夹子7。这一步操作对加样时避免样品经出样口10抽出反应室是很关键的。先取一个盛混合液的三角瓶斜接于冷凝管下端。打开夹子3,,取2mL稀释消化液自加样口3加入反应室1,关闭夹子3。取30%NaOH溶液约10mL