牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备.pdf

两南火学硕十学位论文摘要牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备预防兽医学专业硕士研究生邹励丹指导教师彭远义教授摘要目的以牛乳铁蛋白为抗原,通过动物免疫、间接ELISA方法建立、细胞融合、阳性克隆筛选、亚克隆等步骤,获得能分泌抗体的单克隆细胞株,并制备、纯化腹水,进行效价和特异性鉴定,以获得效价高、特异性强的单克隆细胞株,为下一步研制BLF检测试剂盒奠定基础。方法结合国内外文献报道,依据本实验室的具体情况,将一定量牛乳铁蛋白与弗氏佐剂混合充分乳化,免疫BALB/c小鼠,100弘g/只,共免疫4次(间隔2周);采血测定血清抗体效价并建立间接ELIsA方法,待血清效价大于l:3000时进行细胞融合。取血清效价高的 BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEGl500的作用下进行细胞融合;使用己建立的间接ELISA方法进行筛选,阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆:得到的单克隆细胞株进行扩大冻存及腹水制备。腹水进行效价测定;使用试剂盒测定其抗体亚型,进行抗体纯化、纯度及特异性检测。结果4次免疫后小鼠抗体效价达到1:6400以上。以PEGl500进行细胞融合,融合孔为296 孔,%。经间接ELISA筛选,共得14个阳性孔,%。两次亚克隆后得到两株单克隆细胞株:3C9、4E11。经腹水制备、效价检测等试验,最终确定两者抗体亚型均为IgG2b、K型,SDS—PAGE检测纯度较高。将纯化单抗与牛乳中酪蛋白、*乳清蛋白、肛乳球蛋白和血清白蛋白进行交叉反应性实验结果均呈阴性,表明两株细胞分泌的单抗特异性较好。结论以牛乳铁蛋白为抗原,通过动物免疫、细胞融合、间接ELISA筛选、亚克隆获得两株能分泌抗体的单克隆细胞株,所得单抗特异性较好。关键词:牛乳铁蛋白单克隆抗体两南大学硕十学何论文摘要 Preparation on Monoclonal Antibody against Bovine Lactoferrin Candidate:Zou Lidan AdVisor:Prof Peng (College ofAnimal&1bchn0109y,Southwest Agricultllral UniVers时,Chongqing 4007 16) Ab stract obj∞tiVe1狄e BoⅥm Lacto衙血舔meantig饥,ⅡⅡDugh㈣ing allilml,devel叩iIlg indirectELISA,cen觚i∞,screening positiVeclones孤dsubcloning,t0 get positiVeIn0∞clo鹏ceU ),morloclone cenliI圮sa化meant t0beobtained by雒citespr印ared, ti衙detected andspecific时identified,wllich could be agr0岫dwork 】他of BLF detectiIlg Method Accor‰g t0 tlleconditi∞of ollr lab and litemtu豫reI姗ted de伽地stic 0r la矗oIlal,BLF、Ⅳas emulsified with F陀und’s adjuVaIlt,j舶mlmed 100弘g on BALB/℃mice eVerytime,totally b100d semm antibody tit盯卸ddeVelopping indirect ELISA w邪acted wh∞廿1e blood semm antibody tit盯ri∞t0 1: melli曲b100dsen册删№dy tit盯111ice,岫sple朗cen w雒taken孤ld觚ed、Ⅳinl SP2/0 bone InyelolIla cellby clo鹏s we陀got by i11dnct ELISA sc他饥iIlg孤d subcloned t0 get monocIone celllillesby were enlargedand丘D咖,at tlles锄e time specificity柚d iso帅e w雏 identifiedbyⅡ坞antibody isotype l(it,tlleIlw弱p嘶