黄连上清丸（水丸）、龙胆泻肝丸（水丸）、防风通圣丸（水丸）和风寒咳嗽丸（水丸）中水稻源性成分检查项补充检验方法.docx

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附件1
黄连上清丸（水丸）、龙胆泻肝丸（水丸）、
防风通圣丸（水丸）和风寒咳嗽丸（水丸）
中水稻源性成分检查项补充检验方法
（BJY 202107）
【检查】水稻源性成分
样品制备 供试样品制备 取供试品适量，粉碎，称取10 g，加入65℃预热的TE缓冲溶液（pH ）（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）50ml，65℃水浴振摇至完全分散，，即得。
标准物质样品制备 取水稻源性DNA检测标准物质1支，加无菌超纯水100μl溶解，即得。
空白对照样品制备 ml离心管中，即得。
模板DNA提取 取上述样品，分别选用植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取，得模板DNA溶液，储存于-20℃备用。
PCR反应 鉴别引物：5' TTAGCCTCCCGCTGCAGA3'和5' AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3'。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为25μl，反应体系包含2×PCR预混
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液（包含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等），鉴别引物（50μmol/L），模板DNA（或水稻源性DNA检测标准物质）溶液2μl，。每个样品设置2个平行。PCR反应参数：95℃预变性3分钟，循环反应40次（95℃30秒，62℃30秒，72℃30秒），72℃延伸10分钟，4℃保存反应产物。
电泳检测 照琼脂糖凝胶电泳法（《中国药典》2020年版通则0541），%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品、水稻源性DNA检测标准物质和空白对照溶液的上样量分别为10-20μl，DNA分子量标记物（建议使用DL500）上样量为5μl。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。
系统适用性 （1）空白对照在凝胶电泳图谱中应无条带检出；（2）水稻源性DNA检测标准物质在凝胶电泳图谱50~100bp中应有条带检出。应同时满足以上2个条件，否则实验无效。
克隆测序 使用商业化PCR产物克隆试剂盒，将PC