实验六过氧化氢酶米氏常数Km的PPT课件.pptx

一、实验目的
学习米氏常数（Km）的测定方法。
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二、实验原理
过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：
2H2O2→2H2O+O2↑
H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。
2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 → 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O
求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。
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米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
1 Km 1 1
— = —— . — + ——
v Vmax [S] Vmax
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三、试剂
1．草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，准确称取，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。
2． KMnO4储存液 称取，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。
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3．应用液 取草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成，每次稀释都必须重新标定储存液。
4．约液 取20%H2O2（AR）40ml于量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用标定之，稀释至所需浓度。
5．磷酸盐缓冲液（）。
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四、操作步骤
l．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液，用磷酸盐缓冲液，)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。
2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为的H2O2和25%H2SO4，分别用4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。
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3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。
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加入物(ml)
1
2
3
4
5
H2O2()





蒸馏水




—
血液稀释液





37度保温5分钟
25％硫酸






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依次加入1：1500稀释血液每瓶，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4，边加边摇，使酶促反应立即终止。
最后用4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。
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五、计算
：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。
反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数
即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2
（式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）
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