真核细胞rna提取实验报告.doc

真核细胞rna提取实验报告.doc第1页 / 总共14页
真核细胞rna提取的实验报告范文
篇一：真核细胞RNA的提取
　　一．原理
　　本方法利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，采用有机溶剂抽提去除蛋白质。通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。
　　二．方法
　　
　　⑴组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行RNA提取，或液氮中速冻-70℃保存。
　　⑵贴壁培养细胞处理：用PBS洗细胞一次，吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到-70℃保存；或加入1ml匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。
　　⑶悬浮培养细胞处理：离心收集细胞，用PHS悬浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，则可经液氮速冻后转至一70℃贮存备用。
　　2．加l倍体积盐酸胍匀浆液[至准备好的样品细胞中，高速匀浆1min。
　　3．匀浆液5000g，室温离心10min。
　　4．将上清移至一个干净离心管中，／L乙酸钠（），混匀，再加5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃放置至少2小时。
　　5．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。
第3页 / 总共14页
　　6，每个提取RNA的组织或细胞样品中，加入l0～15min盐酸胍匀浆液Ⅱ，搅拌溶解。
　　7．，立即充分混匀，-20℃至少放置2小时。
　　8．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。
　　9．按每克组织细胞加5min的比例．／L EDTA() 先加1／2体积EDTA振荡l～2分钟，3000g离心2min．吸出上清．再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟．合并两次核酸溶解液。．
　　10．用等体积氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室温离心l0min，5000g室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。
　　11．加3倍体积lmol／L乙酸钠 () 混匀，-20℃放置1h以上，此时RNA将选择地沉淀，而DNA仍为溶解状况。
　　．5000g，0℃离心20min，沉于管底的是RNA。
　　13．吸去上清，用4℃预冷的lmol／L乙酸钠(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃ 5000g，离心20分钟。回收RNA。
　　14．尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液(％SDS，％mol／L EDTA，)。注意：若有SDS沉淀析出．／L NaOH调溶液pH至7．5。
　　15．加入2倍体积冰预冷乙醇混匀，0℃放置至少2小时，5000g，4℃离心10分钟，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。
　　16．用适当小容积DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍体积乙醇，
第3页 / 总共14页
　　-70℃保存RNA备用。用时．／L乙酸钠，混匀，0xxg，4℃离心回收RNA。
　　
　　1．盐酸胍匀浆液Ⅰ
　　成分：8mol／L盐酸胍()，O．1mol／L乙酸钠(pH5．2)，5mmol／L 2—巯基乙醇，％十二烷基肌氨酸钠
　　配制方法：取191g盐酸胍． 3mol／L乙酸钠(pH5．2)和6．25ml 0．2mol／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混匀后加．5ml 10％十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。
　　2．盐酸胍匀浆液Ⅱ
　　成分：8mol／L盐酸胍(),／L乙酸钠(pH5．2),1mmol／L 2
　　—琉基乙醇，20mmol／L EDTA()
　　配制方法：取191g盐酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸钠(pH5．2)和1．25ml 0．2mol
　　／L 2—巯基乙醇溶液中，再加入10ml ／L EDTA()。加水至250ml混匀。
　　
　　％乙醇
　　—正丁醇(4：l，体积比)
　　／L乙醇钠，
第5页 / 总共14页
　　／L乙醇钠，
　　
　　成分：O．2％SDS．／L EDTA,
　　四、说明
　　提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃