奥比岛童话故事 作者奥比岛小奥比---大小爽-word资料(精).doc

:肠上皮细胞是构筑肠道粘膜屏障的主要部分,还具有分泌、吸收等多种功能, 在维持机体生命活动中居重要的地位。在核爆炸、核事故等多种情况下可发生病死率极高的肠型放射病,目前尚无有效的救治方法。肠上皮细胞是辐射敏感细胞,受一定剂量照射后,可发生增殖抑制、结构异常、坏死脱落,而且具有克隆形成能力的隐窝干细胞不能存活和重建小肠的隐窝、绒毛系统,导致肠道屏障的破坏以及修复困难,成为肠型放射病的根本原因。由于在体分离纯化隐窝干细胞存在技术困难, 。,旨在为肠上皮细胞的辐射损伤修复的分子机制研究提供新的靶点,为放射性胃肠综合症提供新的治疗线索,同时将对细胞的增殖、分化、凋亡和转化等基本的生命问题提供启示和答案。方法:本研究以35Gy ,分为两个部分进行。第一部分:。包括以下内容:1),传代致一定数量,待细胞处于对数生长期时, 随机选取一半设为照射组,以∞co为辐射源,进行35Gy一次性照射,另一半为正常对照组,两组在照射时相点后继续培养24h。2)对两组细胞进行总RNA分离,并做定量定性分析。3)(tester),对照组IEC-6来源总RNA为驱动方(driver),LDPCR方法合成双链eDNA。4)Rsal酶切实验方和驱动方eDNA,产生较短的平头末端eDNA片段。5)通过连接反应,产生两种带有不同接头的Tester,而Driver不加接头。6)第一次杂交:过量的Driver eDNA和两种Tester eDNA变性、退火、杂交,使单链TestereDNA片段实现均等化,保留了稀有转录子。第二次杂交:两种消减后的Tester eDNA同时和附加的Diver eDNA杂交,使在第一次杂交中尚未完成杂交的单链Tester cDNA很容易找到互补序列进行退火。最终形成 57末端带有不同接头的杂交体,两种接头提供了抑制性PCR的引物序列,使差异 V 第三军医大学硕士学位论文表达的eDNA通过两轮PCR进行特异性扩增。7)通过比较消减前后eDNA库中已知基因的丰度改变来评价消减效率。8)把正常组作为tester,照射组为driver,按上述步骤进行逆向消减杂交。9)对正向消减PCR产物进行T/A克隆,转化细菌,挑取克隆进行PCR扩增,检测插入片段大小。第二部分:1)反向Northern杂交:用PCR 法扩增插入cDNA片段,碱变性后,点样于尼龙膜上,制作相同拷贝的两张膜,标记正向消减和逆向消减的第二次PCR产物作为探针,分别与膜进行杂交,放射自显影法显示差异片段。2) RNA以及含有克隆U20的T载体质粒电泳后转印、交联在尼龙膜上,以克隆 U20cDNA片段为模板标记的探针杂交,观察U20的表达情况。结果:,完整性好,通过LD PCR的方法获得足量的双链eDNA, TestereDNA片段酶切完全,至少有50%以上的片段连