高效液相色谱讲义.ppt

高效液相色谱讲义
第一页，本课件共有72页
三、色谱流程和仪器
第二页，本课件共有72页
四、HPLC的特点
速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用
第三页，本课件共有72页
第二节 基本理论
一、色谱分 (盐、生物碱)
第二十二页，本课件共有72页
一、离子交换色谱的分离机理
1、
不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时
溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置
换反应的重要因素。
第二十三页，本课件共有72页
2、
P0：流动相中溶质的浓度
Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度
D0：流动相中洗脱剂的浓度
Db：填料表面上洗脱剂的浓度
Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的
洗脱剂的数目。
第二十四页，本课件共有72页
① Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数
② 在Z值不能忽略时
第二十五页，本课件共有72页
在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K’与保留
体积成比例，同时洗脱过程中，Kd， Db是常数，
用Kz表示。
第二十六页，本课件共有72页
3 结论
二、离子交换色谱的固定相
1、高分子类型填料
① 优点
a填料的使用寿命长
b具有较高的色谱容量
c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性
有利。
第二十七页，本课件共有72页
② 结构
以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时
也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。
③ 类型
Mono Beads
TSK-gel DEAE-5PW
SP-5PW
CM-5PW
第二十八页，本课件共有72页
2、无机基质型
三、离子交换色谱的流动相
1、流动相的PH值
① 离子交换容量受流动相的PH值影响
第二十九页，本课件共有72页
② 改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸
性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的
保留值。
③流动相PH值的变化也能改变分离的选择性
④ 对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液
来实现。
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2、流动相的离子强度
四、离子交换色谱的影响因素
1、填料孔径的影响
2、柱长的影响
3、流速的影响
4、PH值的影响
第三十一页，本课件共有72页
无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质
均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保
留选择性、分离度和回收率等因素。
第三十二页，本课件共有72页
5、离子强度的影响
第八节 体积排阻色谱法
一、分离机理
1、体积排阻色谱法（SEC）
或空间排阻色谱法（SEC）
或凝胶色谱法
2、凝胶过滤色谱法（GFC）
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Sephadex 葡聚糖凝胶
第三十四页，本课件共有72页
3、凝胶渗透色谱法（GPC）
4、空间排斥理论
①
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②
V0 死体积，相当于凝胶的粒间体积
Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积
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二、体积排阻色谱法的特点
第三十七页，本课件共有72页
三、体积排阻色谱法的固定相
（一）固定相的分类
1、按固定相基质分类
2、按固定相机械强度分类
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（二）凝胶固定相的特性参数
1、渗透极限
2、分离范围
第三十九页，本课件共有72页
3、固流相比
在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为
固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为
流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积
的比值称作固流相比。
4、柱效
第四十页，本课件共有72页
（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点
①物理因素——影响凝胶色谱柱的性能
② 扩大分离范围——使用两根以上的串联色谱
柱。
③更换流动相
第四十一页，本课件共有72页
谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量
聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。
① 在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加
而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增
大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度
保持不变。
② 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。
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四、体积排租色谱法的流动相
在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值
和分离选择性无影响。
① 溶解样品的良溶剂
② 低黏度溶剂
③ 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀
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④ 控制流动相的PH值和离子强度
⑤ 凝胶渗透色谱——示差折光检测器
流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率
有较大的差别。
凝胶过滤色谱——紫外吸收检测器
使用