实验六细胞核的分离与核酸的鉴定.ppt

实验六细胞核的分离与核酸的鉴定
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；
、细胞质的方法；
；
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一、分离细胞质与细们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。
等密度区带离心法
此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。
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优点：a. 分离效果好，可一次获得较纯颗粒。
b. 适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降 系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。
c. 颗粒不会挤压变形。
缺点：；
；操作严格，不易掌握。
密度梯度区带离心法
(density gradient centrifugation)
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1、核酸的种类及其分布
请思考？
DNA、RNA在细胞中的分布：
DNA
胞核内(98%)
胞质内(2%)
RNA
胞核内(10%)
胞质内(90%)
核酸的种类：
DNA、RNA
结论：DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。
二、核酸的鉴定
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2、核酸的水解
核 酸
核苷酸
磷 酸
碱 基
戊 糖
定糖法（戊糖的差异）
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（1）核糖核酸的鉴定
浓HCl
＋ 3H2O
+
β－ D－核糖
糠醛
糠醛
3，5－二羟基甲苯
绿色化合物
RNA
ＯＨˉ
水解
β－ D－核糖
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（2）脱氧核糖核酸的鉴定
DNA
Ｈ＋
水解
β－D－２－脱氧核糖
-H2O
硫酸
脱氧核糖
ω －羟基－γ－酮基戊醛
蓝色化合物
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（1）分离细胞质与细胞核
（1）分离细胞质与细胞核
（2） 核酸的鉴定
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＋ 少许石英砂研磨
%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤
肝匀浆，倾入离心管
离心：3000r/min；10′
上层液
沉淀
加入1ml 蔗糖柠檬酸溶液
核悬液
沿壁缓铺于8ml
离心：2000r/min；5′
上层液（弃去）
沉淀
核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，5 ′
上层液（弃去）
沉 淀
初步纯化的细胞核
5ml NaOH溶解细胞核
待测样品
鉴定
实 验 流 程 图
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编　 号
1
2
细胞质（滴）
20
-
核　液（滴）
-
20
1mol/LKOH（滴）
20
20
2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:
编　　号
1
2
3
细胞质水解液（滴）
20
-
-
核液水解液（滴）
-
20
-
5％三氯醋酸（滴）
10
10
30
3,5一二羟基甲苯液（滴）
30
30
30
：取离心管二支，编号，按下表操作：
（2） 核糖核酸的鉴定
混合各管
沸水浴(10′)
冷却
加入5%三氯醋酸 (8ml)
搅匀后离心
2000r/min；5′
上清液
立即混合各管
沸水浴(10′)
冷却
比较各管颜色
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2．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:
：取离心管二支，编号，按下表操作：
编　号
1
2
细胞质（滴）
20
-
核　液（滴）
-
20
1mol/L过氯酸(滴）
20
20
编　　号
1
2
3
细胞质水解液（滴）
20
-
-
核水解液（滴）
-
20
-
1mol/L过氯酸（滴）
20
二苯胺试剂（滴）
20
20
20
（3）脱氧核糖核酸的鉴定
混合各管
冷却
离心
上清液
立即混合各管
冷却
比较各管颜色
2000r/min;5′
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试管编号
1
2
3
现　象
试管编号
1
2
3
现　象

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1．规范操作，防止滴管、试剂的污染。
细核悬液的平铺要轻柔；
浓酸的取用要小心；
使用离心机注意平衡，转速从低到