免疫实验结果分析.ppt

第一节 免疫组化结果的判断原则
 
免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：
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⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。
⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜p123-126) 。
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**第四节
阳性标记的形态特征和判断
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免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。内容包括定性、定位和定量三方面。
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免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。
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一、阳性标记免疫特征：分"弱(+)、中(++)、强(+++)"三级。免疫荧光法（FITC为例） 则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；
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免疫酶标记（HRP- DAB/H2O2）则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影，原则上多取强阳性区域。
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二、阳性标记细胞学特征（以HRP-DAB/H2O2为例） 可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④微绒毛型和⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。
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三、阳性标记组织学特征（以HRP-DAB/H2O2为例） 免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下7种：①局灶型；②弥漫型；③片块型；④网状型；⑤腺管型；⑥腔缘型和⑦菊团型，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。
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四、阳性标记强度特征 依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+）┅1分；中等阳性（++）┅2分；强阳性（+++）┅3分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（+ ，指阳性细胞数在25%以下）┅1分；
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中等阳性（++,指阳性细胞数在25%—49%) ┅2分；强阳性（+++ ，指阳性细胞数在50%以上) ┅ 3分。目前多采用积分综合计量。计算公式：两者相乘（或相加）。大多主张<3者为阴性，>4者为阳性，>6者为强阳性，至少随机观察5-10个HPF,取其均值。
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第五节
染色失败的可能原因
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免疫组化染色的基本要求有二：①实验切片的阳性抗原定位准确，呈色鲜明，背景着色浅或无，二者的比值应大于1（阳性/背景）；②对照染色的结果应附合要求。否则，所得实验结果都是错误的，或为假阳性或为假阴性。
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假阳性是指实验切片呈阳性，阴性组织对照或阴性试剂对照也呈阳性的结果，谓之假阳性。其原因与内源性干扰，试剂不纯，交叉反应等有关。
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假阴性是指实验切片呈阴性，阳性组织对照及阴性试剂对照也均呈阴性的结果，谓之假阴性。其原因与组织处理不当，组织细胞抗原丢失或试剂错误(如漏加、错加、失效、变质等),操作失误等有关。
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对照结果判断：
表中1～5结果无效，6、7结果可靠
（＋）
（＋）
（＋）
（－）
（＋）
（＋）
（－）
检测标本含抗体，结果可靠
（＋）
（－）
（－）
7
检测标本不含抗体结合可靠
（－）
（－）
（－）
6
非特异染色
（＋）
（＋）
（－）
5
阳性对照不含定位抗原
（＋）
（－）
（－）
4
阴性对照内含定位抗原
(＋)(－)
（－）
（＋）
3
非特异性染色
（＋）
（＋）
（＋）
2
抗体失活，操作有误
（－）
（－）
（－）
1
结果判断
检测结果
替代对照
阴性对照
阳性对照
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染色失败原因：
均为阴性
均为弱阳性（除阴性对照）
背景染色过深
阳性对照好，待检标本弱阳性
阳性对照无背景，待检标本背景深
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判断原则：

实验设计
抗体选择
抗原定位性
抗原分布不均一性
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假阴性常见原因：抗原丢失或减弱
抗体失效或稀释度不当
操作失误
假阳性常见原因：抗原弥散
抗原异位表达
瘤细胞吞噬
病变中正常组织残留
抗体交叉反应